[發明專利]一種用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體

無效

• 申請號: 201010164368.3
• 申請日: 2010-05-06
• 公開（公告）號: CN101864420A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 李世崇;陳昭烈;葉玲玲;劉紅;吳本傳;劉興茂;王啟偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/11
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

技術領域

本發明涉及一種用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體。具體地說是利用HEK293細胞的看家基因肽延伸因子的轉錄調控序列促進外源基因在HEK293細胞中的高效表達。

背景技術

HEK293細胞是Graham等在1977年構建的永生化人胚腎上皮細胞系。因其具有良好的翻譯后修飾能力而被廣泛的用于諸多人源蛋白質的功能研究，同時它也被廣泛的用作病毒的包裝宿主。在細胞工程領域，HEK293細胞也得到了應用，例如生產人蛋白C。人源宿主細胞中所特有的一些酶類有利于幫助重組蛋白折疊成正確的構象從而改善其生物學活性。例如，人源宿主細胞中存在α-2，6唾液酸轉移酶，它對蛋白進行α-2，6位的唾液酸修飾，能提高蛋白的生物學活性，具有α-2，6唾液酸連接的低聚糖的tPA(tissue?plasminogen?activator，組織型纖溶酶原激活劑)產品質量提高。在人源宿主細胞中含有β1，4-N-羥乙酰神經氨酸轉移酶III(GnTIII)，對目的蛋白進行修飾，可延長糖蛋白的半衰期。用具有此酶的宿主細胞生產的單克隆抗體，對于誘導ADCC(antibody-dependentcell-mediated?cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導細胞毒作用)更為有效，可減少抗體用量。因此有必要開發以人源細胞為宿主的重組蛋白表達系統。

啟動子的強弱直接關系到外源基因在宿主細胞中的表達水平，為提高外源基因的轉錄效率，必須盡可能的選用高活性的啟動子。目前在真核細胞中最常用的啟動子為人的CMV啟動子，它有比較廣泛的宿主細胞，也是比較強的啟動子。但是研究發現，該啟動子內存在CpG島容易導致沉默效應；僅在細胞周期的S期起作用，因此尋找比CMV更好的啟動子是必要的。人們一直在尋找，高強度適應性廣的啟動子，Kalwy?S用鼠的mCMV啟動子在CHO-K1細胞中表達GFP，是人的CMV啟動子的3倍，但在表達抗體這樣的蛋白時，表達能力卻比較弱不如人的CMV啟動子。Gershon?TJ等通過人工設計合成了一個能夠增加基因表達的核心啟動子，體內外研究表明：它比CMV核心啟動子顯著性提高報告基因熒光素酶的表達水平，這就為尋找高活性啟動子提供了另一種思路，有可能創造出自然界不存在的高強度的人工啟動子。ProBioGen公司，克隆了細胞內廣泛存在的啟動子，強度比CMV強，非細胞周期依賴，能夠對抗基因沉默，在細胞中穩定表達50代以上，很可能細胞內源性啟動子更有利于重組蛋白基因的轉錄調控。

肽延伸因子在細胞整個周期中都處于高表達，不受細胞周期影響的看家基因，其基因座序列可能含有一些有利于基因表達的轉錄調控序列，與細胞的反式作用因子共同作用，促進基因的高表達。我們根據Genbank的報告的序列，克隆了HEK293細胞的肽延伸因子1的5′端和3′端4Kb的調控序列，用來構建不同的表達載體，以EGFP為報告基因，確定了同時存在肽延伸因子1的5’端和3’端的調控序列時EGFP的表達水平最高，為對照載體的7倍。用這個載體在HEK293細胞中表達外源基因tPA和proUK能夠提高表達2-5倍。

肽延伸因子的轉錄調控序列與我們構建的人工轉錄因子結合，能夠提高EGFP的表達15倍。

發明內容

本發明的目的是提供一種在HEK293細胞中高效表達外源基因的載體。

本發明的另一目的在于提供上述載體的構建方法。

本發明的第三個目的在于是提供這種載體的調控元件的核苷酸序列，其具有序列表中SEQ?No.1和SEQ?No.2所述的序列。

本發明的第四個目的是提供調控元件的組合應用。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

培養HEK293細胞，然后提取基因組DNA，通過PCR的方法擴增人HEK293細胞的肽延伸因子1的5’端和3’端4kb的調控序列，用調控序列的不同組合，以EGFP為報告基因，通過流式細胞儀測定EGFP的熒光強度，確定載體的最佳組合，再用外源基因tPA和proUK(prourokinase，尿激酶原)驗證其有效性。

一種用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體，其具有圖2E所示結構。