[發明專利]一種用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體

無效

• 申請號: 201010164368.3
• 申請日: 2010-05-06
• 公開（公告）號: CN101864420A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 李世崇;陳昭烈;葉玲玲;劉紅;吳本傳;劉興茂;王啟偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/11
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

1.一種轉錄調控外源基因在HEK293細胞中高效表達的5’端核苷酸序列，其具有序列表中SEQ?ID?No.1所述的序列。

2.一種調控外源基因在HEK293細胞中高效表達的3’端核苷酸序列，其具有序列表中SEQ?ID?No.2所述的序列。

3.人的肽延伸因子1的基因5’端和3’端轉錄調控序列組合構建的高效表達載體。

4.一種用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體，其特征在于，其具有圖2E所示結構。

5.根據權利要求4所述的用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體，其特征在于，其是對pCDNA3.1(+)進行改構，引物BGH1(SEQ?ID?No.7)含XbaI酶切位點，BGH2(SEQ?ID?No.8)含BspEI酶切位點，FOR1(SEQ?ID?No.9)含BspEI酶切位點，FOR2(SEQ?ID?No.10)含XmaI酶切位點；通過PCR的方法以pCDNA3.1(+)為模板，分別擴增出200bp和800bp的片斷，膠回收后分別用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片斷，XbaI、XmaI酶切后膠回收大片斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在pcDNA3.1(+)的BGHPA處引入BspEI酶切位點；在改構的pcDNA3.1(+)的EcoRV處連入EGFP報告基因得出pcDNA3.1(+)/EGFP載體，利用SEQ?ID?No.1所示的肽延伸因子1基因5’端調控序列和SEQ?ID?No.2所示的肽延伸因子1基因3’端調控序列替代替換pcDNA3.1(+)/EGFP中的CMV啟動子和BGHPA。

6.根據權利要求5所述的用于HEK293細胞高效表達外源基因的表達載體，其特征在于，在權利要求5所述載體的上游加上人工轉錄因子結合序列2UAS。

7.一種構建權利要求5所述載體的方法，其特征在于，具有如下步驟：

(1)提取HEK293基因組DNA；

(2)利用SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示引物擴增肽延伸因子1的4Kb的5’端調控序列，擴增產物含NheI和MluI酶切位點，所述肽延伸因子1的5’端調控序列具有SEQ?ID?No.1所示序列；

(3)再利用SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示引物擴增肽延伸因子1的4Kb的3’端調控序列，所述肽延伸因子1的3’端調控序列具有SEQ?ID?No.2所示序列，擴增產物含XbaI和BspEI酶切位點；

(4)對pCDNA3.1(+)進行改構，引物BGH1(SEQ?ID?No.7)含XbaI酶切位點，BGH2(SEQ?ID?No.8)含BspEI酶切位點，FOR1(SEQ?ID?No.9)含BspEI酶切位點，FOR2(SEQID?No.10)含XmaI酶切位點；通過PCR的方法以pCDNA3.1(+)為模板，分別擴增出200bp和800bp的片斷，膠回收后分別用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片斷，XbaI、XmaI酶切后膠回收大片斷，再將載體與200bp和800bp片斷連接，至此在pcDNA3.1(+)的BGHPA處引入BspEI酶切位點；

(5)在步驟(4)改構的pcDNA3.1(+)的EcoRV處連入EGFP報告基因得出pcDNA3.1(+)/EGFP載體；

(6)利用SEQ?ID?No.1所示的肽延伸因子1基因5’端調控序列和SEQ?ID?No.2所示的肽延伸因子1基因3’端調控序列替代替換pcDNA3.1(+)/EGFP中的CMV啟動子和BGHPA。

8.一種構建權利要求6所述載體的方法，其特征在于，在權利要求6所述步驟(6)制備得到都得載體上游加上人工轉錄因子結合序列2UAS。

9.一種用于擴增權利要求1所述轉錄調控外源基因在HEK293細胞中高效表達的5’端核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ?ID?No.3和SEQ?IDNo.4所示序列。

10.一種用于擴增權利要求2所述轉錄調控外源基因在HEK293細胞中高效表達的3’端核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ?ID?No.5和SEQ?IDNo.6所示序列。