[發(fā)明專利]多重定量核酸擴增及解鏈測定法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010163977.7
• 申請日: 2010-03-10
• 公開（公告）號: CN101831496B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發(fā)明（設計）人: R·希古奇;C·霍爾康布
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 李波,付磊

技術領域

本發(fā)明整體上涉及核酸的體外擴增、檢測和定量。特別地，本發(fā)明涉及單管多重測定法(single-tube multiplex assay)，其能夠應用復數(shù)個被標記相同熒光報告標記的雜交探針，同時擴增、檢測和定量復數(shù)個靶核酸。所述測定法可應用多種熒光報告基團來進一步復雜化(multiplexed)。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)已經(jīng)成為生物醫(yī)學研究、疾病監(jiān)測和診斷的一種普及的工具。美國專利4,683,195、4,683,202以及4,965,188中描述了通過PCR擴增核酸序列。PCR是現(xiàn)今本領域眾所周知的技術，并廣泛描述于科技文獻中(參見PCR Applications，(1999)Innis等編輯，Academic Press，San Diego；PCRStrategies，(1995)Innis等編輯，Academic Press，San Diego；PCR Protocols，(1990)Innis等編輯，Academic Press，San Diego以及PCR Technology，(1989)Erlich編輯，Stockton Press，New york)。“實時”PCR分析能夠同時擴增和檢測并且定量靶序列的起始量。應用DNA聚合酶的核酸酶活性的基礎TaqMan實時PCR分析描述于Holland等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：7276-7280以及美國專利5,210,015。不需要核酸酶活性(無核酸酶分析)的實時PCR描述于2008年12月9日提交的美國申請系列號12/330,694。熒光探針在實時PCR的應用描述于美國專利5,538,848。

典型的實時PCR方案(protocol)涉及使用特異于每個靶序列的標記探針。優(yōu)選地，探針被標記一個或更多個熒光基團(moiety)，所述的熒光基團發(fā)射可檢測波長的光。在雜交至靶序列或其擴增子后，探針顯示出在熒光發(fā)射上的可檢測變化。

然而，在單管內分析多個靶的能力仍然是實時分析的主要挑戰(zhàn)。幾乎在醫(yī)藥以及診斷的每一個領域，被關注位點(loci)的數(shù)量迅速增長。例如，僅舉幾例，在法醫(yī)DNA鑒定、病原微生物檢測、多位點遺傳疾病篩選以及多基因表達研究中必須分析多個位點。

利用目前的方法，多重分析的能力受限于檢測儀器。特別地，相同反應中應用復數(shù)個探針要求采用不同的熒光標記。為同時檢測復數(shù)個探針，儀器必須能夠區(qū)分每個探針所發(fā)射的光信號。目前的技術不允許在相同反應容器中超過四個單獨波長的檢測。例如，Bell等(“Real-time quantitative PCR in parasitology”，Trends in Parasitol.(2002)18(8)：337-342.)最近已調查了可用的實時定量PCR熱循環(huán)儀，并報道都不能具有超過四個光學檢測通道。因此，每個靶應用一個獨特標記的探針，在同一反應容器中可檢測不超過四個單獨的靶。在實踐中，至少一個靶通常是對照核酸。因此，在實踐中，同一管內可檢測不超過三個實驗靶。由于光學硬件最多允許做很小的增量改進，多重分析的能力將跟不上臨床需要，除非擴增以及檢測策略進行根本變革。

PCR后解鏈分析提供了額外的多重實時擴增反應能力(參見2006年6月23日提交的US2007-0072211)。在解鏈分析中，擴增的核酸通過其獨特的解鏈曲線圖(melting profile)來鑒定。解鏈分析涉及測定雙鏈靶或者標記探針與靶的雙鏈體的解鏈溫度(解鏈點(melting point))。如美國專利5,871,908所描述的那樣，為測定應用了熒光標記探針的解鏈溫度，靶核酸和探針的雙鏈體在受控溫度程序下逐步加熱(或冷卻)。雙鏈體的解離改變了相互作用的復數(shù)個熒光團或熒光團與淬滅劑之間的距離。相互作用的熒光團可綴合至單獨的探針分子，如美國專利6,174,670所述的那樣。備選地，一個熒光團可綴合至探針，而其它的熒光團可嵌入核酸雙鏈體，如美國專利5,871,908所述的那樣。作為另外一個備選，熒光團可綴合至單個探針寡核苷酸。在雙鏈體解鏈后，由于此時在單鏈探針中熒光團與淬滅劑靠攏，因此熒光團被淬滅。