[發明專利]多重定量核酸擴增及解鏈測定法

有效

• 申請號: 201010163977.7
• 申請日: 2010-03-10
• 公開（公告）號: CN101831496B
• 公開（公告）日: 2017-04-12
• 發明（設計）人: R·希古奇;C·霍爾康布
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 李波,付磊

1.在單個樣品容器中同時多重實時PCR擴增、檢測并定量一種或更多種靶核酸的方法，其包括步驟：

(a)使懷疑含有一種或更多種靶核酸的樣品與至少一組寡核苷酸探針相接觸，其中所述組內每個寡核苷酸探針被標記相同的一個或更多個報告基團，其中每個所述標記寡核苷酸探針

i.充分互補于至少一種靶核酸的至少一個子序列；

ii.能夠以不同于同組內其它標記寡核苷酸探針解鏈溫度的解鏈溫度與相應靶核酸結合；

(b)在包括溫度變化區間的擴增反應循環中擴增樣品中的靶核酸，其中所述標記寡核苷酸探針從與相應靶核酸的雜合子解離；

(c)檢測在至少部分所述溫度變化區間上來自所述報告基團的光發射；以及

(d)對步驟(c)中在溫度變化區間的至少所述部分上檢測的光發射的一階導數進行作圖；

(e)確定步驟(d)中作圖的所述導數的最大值；

(f)重復步驟(b)至(e)復數次；以及

(g)將步驟(e)確定的所述導數最大值相對于步驟(b)至(e)的循環數或重復數目進行作圖，并確定步驟(e)中確定的數值到達預設閾值時的循環數或重復數目，從而定量所述靶核酸的相對量。

2.權利要求1所述的方法，其中對濃度已知的對照核酸與所述靶核酸同時進行步驟(a)-(f)，并且將步驟(g)中確定的每個靶核酸的值與步驟(g)中確定的對照核酸的值進行比較，從而確定每個所述靶核酸的絕對量。

3.權利要求1和2任一項的方法，其中步驟(a)中每個所述寡核苷酸探針被標記單個報告基團。

4.權利要求3所述的方法，其中所述報告基團是熒光的。

5.權利要求1和2任一項的方法，其中步驟(a)中的每個所述寡核苷酸探針被標記報告基團和淬滅基團。

6.權利要求5所述的方法，其中所述報告基團和所述淬滅基團是熒光團。

7.權利要求5所述的方法，其中所述報告基團是熒光團而所述淬滅基團是暗淬滅劑。

8.權利要求5所述的方法，其中所述報告和淬滅基團被核酸酶切割位點分隔。

9.權利要求1、2、4和6-8任一項所述的方法，其進一步包含至少一個用于在步驟(b)之前擴增樣品中的靶核酸的擴增循環。