[發明專利]一種針對一個或多個目標基因組區域進行邊擴增邊連接的方法

有效

• 申請號: 201010163648.2
• 申請日: 2007-08-15
• 公開（公告）號: CN101824412A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 張秀清;蘇夜陽;林琳;汪建;楊煥明
• 申請（專利權）人: 北京華大基因研究中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 程泳

本申請是申請日為2007年8月15日、申請號為200710143624.9的同名專利申請的分案申請。?

技術領域

本發明涉及一種針對一個或多個目標基因組區域進行邊擴增邊連接的公用接頭設計方法。本發明又涉及一種針對一個或多個目標基因組區域進行邊擴增邊連接的方法。本發明所述方法適用于針對任意長度的目標基因組區域的邊擴增邊連接工作，所得到的非特異連接的長鏈DNA可根據研究需要應用于多種DNA分析平臺。本發明還涉及一種針對一個或多個目標基因組區域序列重測序工作、建立隨機DNA文庫的方法，所得隨機DNA文庫可用于通過包括Sanger測序技術、邊合成邊測序技術在內的測序方法對所述一個或多個目標基因組區域序列進行重測序。?

背景技術

自1983年Kary?Mullis發明聚合酶鏈式反應(polymerase?chainreaction，PCR)以來，歷經三十多年，PCR技術已成為生物科學領域不可或缺的、運用廣泛的實驗技術。為不同的實驗目的，在標準PCR基礎上又衍生出RT-PCR(Reverse?Transcriptase?PCR，逆轉錄PCR)、Inverse?PCR(反向PCR)，In?Situ?PCR(原位PCR)，Long?PCR(長PCR)，Real?Time?PCR(實時PCR)，Single?Cell?PCR(單細胞PCR)，Hot?Start?PCR(熱啟動PCR)，Colony?PCR(菌落PCR)，AFLPPCR(Amplified?Fragment?Length?Polymorphism?PCR，擴增片斷長度?多態性PCR)等多項技術手段。可以說，自PCR技術問世以來，分子生物學及之后的基于大規模測序反應的基因組學均得到了飛速的發展。?

本發明應用堿基互補配對的基本原理，通過設計含“公用接頭”的目標基因組區域的引物，在第一輪多核苷酸擴增反應后，第二輪多核苷酸擴增反應中，將目標基因組區域在擴增的基礎上進行高效地連接，即“邊擴增邊連接”。連接工作按隨機順序進行，在本發明的上下文中這種隨機順序連接的方式稱為“非特異連接”。經過邊擴增邊連接得到由目標基因組區域的DNA片段經“非特異連接”而成的長鏈DNA，此長鏈DNA可根據研究需要應用于多種DNA分析平臺。?

通過本發明提出的“邊擴增邊連接”方法獲得長鏈DNA，并經過DNA隨機打斷法打斷，可建立用于通過包括Sanger測序技術、邊合成邊測序技術在內的測序方法對所述一個或多個目標基因組區域序列進行重測序工作的隨機DNA文庫。?

本發明可運用于一個目標基因組區域的邊擴增邊連接和隨機DNA文庫建立工作，也可用于兩個及兩個以上的多個目標基因組區域邊擴增邊連接和隨機DNA文庫建立工作。?

設計目的的不同，使本發明提出的“邊擴增邊連接”反應與同樣使用接頭設計的串聯PCR方法具有本質的分別：串聯PCR是根據具體研究的需要，進行特殊的接頭設計，將本屬基因組不同區域的DNA，甚至是不同物種基因組的DNA片斷進行“特異性”連接，以獲得研究所需要的“功能性DNA片段”。而本發明是為了得到特異擴增的、“非特異連接”的長鏈DNA。?

在本發明中，除在目標基因組區域的引物設計中在正向引物和反向引物的5’端和3’端分別加上本發明提出的一對反向互補的公用接頭外，兩輪多核苷酸擴增反應均無需特殊處理；非特異連接長鏈DNA的生成無需“連接酶”作用。?

本發明獲得的長鏈DNA可突破在保真要求限制下的長PCR(LongPCR)方法目的片段長度的限制，而且可免去使用包含特殊酶物質的試劑盒及設計更嚴格引物的麻煩；與使用同連接區域特異配對之接頭的?串聯PCR(overlap?PCR)方法相比，本發明只需設計一對公用接頭，在第二輪多核苷酸擴增反應中利用公用接頭將目標基因組區域原始DNA片段按隨機順序連接，又免去了設計多對可用于特異串聯的互補引物的工序，對本行業的技術人員來說本發明所涉及的實驗室工作是簡單易行且費用很低的。?

發明內容

本發明基于以下認識：在目標基因組區域的每對引物設計中加入反向互補的同一對“公用接頭”(Universal?Adaptor)，對目標基因組區域的原始DNA片斷進行特異性多核苷酸擴增和非酶法連接，形成由目標基因組區域DNA片段按隨機順序連接而成的長鏈DNA混合物。?