[發(fā)明專利]一種重組惡臭假單胞菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010163000.5
• 申請日: 2010-05-05
• 公開（公告）號: CN101899413A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 武俊;杜宏偉;楊柳燕;肖琳;李麗觀;呂志剛;陳洪齡;凌小君;張全興
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學;江蘇江達生態(tài)科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/63;C02F1/58;C02F3/34;C12R1/40;C02F101/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組惡臭假單胞菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，利用該重組惡臭假單胞菌可以去除生活污水中的磷。

背景技術(shù)

無機磷酸鹽通常被認為是湖泊富營養(yǎng)化的關(guān)鍵因子。因而，降低水環(huán)境中磷的濃度是控制富營養(yǎng)化的重要手段之一。

環(huán)境中磷的去除有物理、化學以及生物法。生物尤其是微生物，去除磷的機理在于包括Escherichia?coli，Pseudomonas?spp.等細菌均具有積累無機磷酸鹽，生成多聚磷酸鹽(poly-phosphate)的能力。但是，在天然條件下，微生物聚磷能力通常比較弱，或者需要厭氧好氧交替環(huán)境才能有效聚磷。

多聚磷酸鹽由聚磷激酶(Poly-phosphate?Kinase，PPK)催化形成。是由3～1000多個不等的正磷酸鹽通過高能磷酸鍵連接而成的線性多聚體。聚磷通常被認為是能量儲存的一種手段，同時具有多種生理功能。有學者通過轉(zhuǎn)基因手段，將聚磷酸激酶基因ppk轉(zhuǎn)化到各種質(zhì)粒中，過量表達聚磷激酶。攜帶重組有ppk基因質(zhì)粒的微生物或植物能夠過量的吸收環(huán)境中磷酸鹽形成大量聚磷。從而用于廢水中磷的去除或者利用聚磷的絡(luò)合能力降低環(huán)境中重金屬毒性，增加重金屬的生物有效性，增加植物對重金屬的耐受性，提高植物對重金屬的去除能力等。通過重組質(zhì)粒表達ppk基因，雖然能夠過量的表達聚磷激酶，但是，質(zhì)粒表達的缺點同樣明顯，重組質(zhì)粒容易丟失。只有在抗生素脅迫下才能夠相對穩(wěn)定存在，由此引發(fā)實際應(yīng)用成本的增加。并且高拷貝質(zhì)粒對菌的生命活動造成負擔。因而質(zhì)粒作為載體表達ppk基因有很大的局限。另外，當前用于廢水中去除磷的研究中所用表達宿主全部為E.coli。E.coli直接用于廢水或自然水體磷的去除是不切實際的。

整合表達一定程度上解決了質(zhì)粒表達的遺傳不穩(wěn)定的問題，同時選擇環(huán)境中以及廢水處理的活性污泥中的優(yōu)勢種惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)作為宿主，可以用于實際的廢水處理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有較高遺傳穩(wěn)定性的重組惡臭假單胞菌，能夠高效去除廢水中的磷。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述重組惡臭假單胞菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種重組惡臭假單胞菌，它是DNA整合表達聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)。

上述重組惡臭假單胞菌的構(gòu)建方法，它包括ppk基因的獲取、載體的構(gòu)建、三親接合三大步驟，具體步驟如下：

(1)ppk基因的獲?。?/p>

(1a)提取E.coli?DH5α總DNA，具體方法參見《環(huán)境微生物實驗技術(shù)》(北京：中國環(huán)境科學出版社，2004.71-72)。

(1b)根據(jù)大腸桿菌的基因序列(Genbank登錄號：L03719)設(shè)計引物，并在引物5’端加入EcoR?V酶切位點，以總DNA為模板，PCR擴增ppk基因。

(2)載體的構(gòu)建：

(2a)將步驟(1b)得到的PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pBBR1MCS-2中，獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk；具體為將質(zhì)粒pBBR1MCS-2以及步驟(1b)得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRV酶切，質(zhì)粒pBBR1MCS-2進行去磷酸化反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)磷酸化反應(yīng)，在5’端加磷，然后將上述處理的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒酶連反應(yīng)過夜，即獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk。

(2b)將步驟(2a)得到的重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α進行復制。

(2c)提取重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk，作為模板，設(shè)計含有NoT?I酶切位點的引物，PCR擴增含有多克隆位點上游多重啟動子序列和多克隆位點下游終止子序列的片段；

(2d)將步驟(2c)得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Not?I酶切后插入到自殺質(zhì)粒pUTmini-Tn5中，得到重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5-ppk。

(3)三親接合：

(3a)將步驟(2d)得到的重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5-ppk經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到供體菌E.coliSM10(λpir)(電擊轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細胞的制備參見《分子克隆指南》【3^rd，北京：科學出版社.2002.】)。