[發(fā)明專利]一種重組惡臭假單胞菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010163000.5
• 申請(qǐng)日: 2010-05-05
• 公開（公告）號(hào): CN101899413A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武俊;杜宏偉;楊柳燕;肖琳;李麗觀;呂志剛;陳洪齡;凌小君;張全興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué);江蘇江達(dá)生態(tài)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/54;C12N15/63;C02F1/58;C02F3/34;C12R1/40;C02F101/10
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種重組惡臭假單胞菌，其特征在于它是DNA整合表達(dá)聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)。

2.權(quán)利要求1所述的重組惡臭假單胞菌的構(gòu)建方法，其特征在于它包括如下步驟：

(1)ppk基因的獲取：

(1a)提取E.coli?DH5α總DNA；

(1b)根據(jù)大腸桿菌的基因序列設(shè)計(jì)引物，以總DNA為模板，PCR擴(kuò)增ppk基因；

(2)載體的構(gòu)建：

(2a)將步驟(1b)得到的PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pBBR1MCS-2中，獲得重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk；

(2b)將步驟(2a)得到的重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α進(jìn)行復(fù)制；

(2c)提取重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-ppk，作為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增含有多克隆位點(diǎn)上游多重啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)下游終止子序列的片段；

(2d)將步驟(2c)得到的PCR產(chǎn)物插入到自殺質(zhì)粒pUTmini-Tn5中，得到重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5-ppk；

(3)三親接合：

(3a)將步驟(2d)得到的重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5-ppk經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到供體菌E.coliSM10(λpir)；

(3b)將受體菌Pseudomonas?putida?KT2440、步驟(3a)得到的含重組質(zhì)粒的供體菌E.coli?SM10(λpir)/pUTmini-Tn5-ppk、輔助菌E.coli?DH5α(pRK600)，分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，在受體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為25μg/mL的氯霉素，在供體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/mL的卡那霉素和25μg/mL的氯霉素，在輔助菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/mL的卡那霉素和25μg/mL的氯霉素；

(3c)將步驟(3b)培養(yǎng)后的受體菌、供體菌和輔助菌按照1∶2∶2的體積比三親接合，獲得重組惡臭假單胞菌KT2440-PPK。

3.權(quán)利要求1所述的重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應(yīng)用。