[發(fā)明專利]微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫脂肪酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010162740.7
• 申請日: 2010-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN102093988A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張慶芳;遲乃玉;竇少華;于爽
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20
• 代理公司: 大連智慧專利事務(wù)所 21215
• 代理人: 周志艦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫脂肪酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫脂肪酶主要應(yīng)用于洗滌行業(yè)、食品工業(yè)、紡織、印染、造紙工業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)等其它脂肪酶應(yīng)用行業(yè)?？梢蕴岣咴系睦寐?、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。

背景技術(shù)

脂肪酶(甘油酯水解酶，EC?3.1.1.3)是可催化天然底物油脂(甘油三脂)水解，產(chǎn)生脂肪酸和甘油的一類特殊酯鍵水解酶(孫謐，微生物學(xué)報(bào)，2004)。脂肪酶作為生物制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于洗滌行業(yè)、食品工業(yè)、紡織、印染、造紙工業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)等其它脂肪酶應(yīng)用行業(yè)。目前應(yīng)用的脂肪酶主要為高溫和中溫型脂肪酶，而關(guān)于低溫脂肪酶的研究相對較少，仍處于起步階段，主要是研究菌種選育、產(chǎn)酶條件優(yōu)化、酶學(xué)性質(zhì)及相關(guān)基因克隆等(宋欣等，微生物學(xué)通報(bào)，2002；董宏偉，海洋與沼澤，2004；孫新城等，食品科技，2009)。有關(guān)低溫脂肪酶產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用方面還未見報(bào)道。低溫脂肪酶與高溫、中溫型脂肪酶相比具有巨大應(yīng)用優(yōu)勢，因?yàn)榈蜏刂久冈诘蜏叵戮哂懈呙富盍案叽呋?，可大大縮短處理過程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢；經(jīng)過溫和的熱處理可使低溫酶的活力喪失；低溫或適溫處理有助于提高產(chǎn)品品質(zhì)和質(zhì)量。低溫脂肪酶的應(yīng)用將對傳統(tǒng)的食品、醫(yī)藥、化工、能源和環(huán)保等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫脂肪酶，用于食品洗滌劑、食品乳化劑、化妝品、藥品等領(lǐng)域可以顯著的提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量，可以從根本上擺脫中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。低溫脂肪酶將為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如資源、能源危機(jī)以及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇。低溫脂肪酶具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，該方法主要是微生物經(jīng)過低溫馴化后，在14～20℃液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫脂肪酶粗酶液活性可以達(dá)到180U/mL，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該酶制劑應(yīng)用操作簡單、方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊庵袦?、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。

本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫脂肪酶的方法具體包括以下步驟：

(1)將產(chǎn)生脂肪酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；

(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的脂肪酶產(chǎn)生菌在14～20℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；

(3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在14～20℃培養(yǎng)48～120h，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫脂肪酶結(jié)束；

(4)將(3)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；

(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。

本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進(jìn)行。脂肪酶產(chǎn)生菌(CGMCC菌種編號(hào)：1.504或1.775或1.893或1.2172等)，菌株先活化，再經(jīng)過逐級(jí)低溫馴化，發(fā)酵生產(chǎn)低溫脂肪酶時(shí)按本發(fā)明方法進(jìn)行培養(yǎng)，低溫馴化后的菌株斜面在4℃環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10～25％甘油制成的菌懸液、在零下80℃條件下可以長期保藏。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例一：

(1)、培養(yǎng)基制備

①菌種活化培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，瓊脂15g，蒸餾水1.0L，pH自然，121℃蒸氣滅菌30min。

②菌種低溫馴化培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g～50.0g，橄欖油5.0g～8.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH自然，121℃蒸氣滅菌30min。

③液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g～50.0g，酵母提取物5.0g～8.0g，橄欖油4.0～8.0g，MgSO₄·7H₂O?0.5～1.0g，KH₂PO₄1.0～5.0g，自來水1.0L，pH自然，121℃蒸氣滅菌30min。