[發明專利]一種丙酮丁醇梭菌及其構建方法和用途

有效

• 申請號: 201010162515.3
• 申請日: 2010-05-05
• 公開（公告）號: CN101845413A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 劉力強;牛昆;賈娟娟;楊明;武芳;閆海榮;范俊輝;邸勝苗;馮文亮;楊麗萍;時蕾;石晨光;王正品
• 申請（專利權）人: 華北制藥集團有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/03;C12P7/16;C12P7/06;C12P7/04;C12R1/145
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發明涉及丙酮丁醇梭菌及其構建方法和用途。

背景技術

近年來，由于石油等化石資源的日益匱乏，采用丙酮-丁醇發酵將生物質轉化為化學品和液體燃料的方法又重新成為人們關注的重點。傳統的丙酮-丁醇發酵是以玉米或糖蜜為基質，接入丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)進行發酵，其發酵產物為丙酮、丁醇、和乙醇，其比例為3∶6∶1，混合醇占總容劑量的70％，其中丁醇占總容劑量的60％。由于丁醇能量含量高、揮發性小、與汽油混合對水的寬容度大、與其他生物燃料相比安全性高、溫室氣體排放少，因此，人們大多認為提高丁醇在溶劑中的比例非常有意義。為此，研究人員一直在致力篩選或構建性能更為優良的丙酮丁醇梭菌。目前已有許多新的技術方案。如CN101423813A公開了一種重組梭菌及其構建方法與應用，該重組梭菌是由編碼甲酸脫氫酶的基因導入梭菌中構建而成。所述梭菌可用于丙酮-丁醇發酵，從而生產丁醇，其丁醇產量可達到14.1g/L。CN101423815A公開了另一種用于丙酮-丁醇發酵的重組丙酮丁醇梭菌。該重組丙酮丁醇梭菌是由含有FoF1型ATP合酶的親水部分的編碼基因的DNA片段導入丙酮丁醇梭菌中構建而成，用其發酵生產丁醇產率最高可達到13.7g/L。但這些方法均為基因工程技術，故技術手段復雜、制造成本高。為解決這一問題，CN101250496公開了一種丙酮丁醇梭菌(SB-1?CGMCC?№.2287)，其用于發酵生產生物醇，所得混合醇占總容劑比可達77～82％，丁醇占總容劑比可達68～75％。該方法的不足之處在于，該方法采用的依舊是傳統的菌種篩選法，故其篩選效率、數量都有可能嚴重制約該方法的工業化應用。

發明內容

本發明的目的就是要提供一種可有效提高生物產醇量的丙酮丁醇梭菌；同時提供一種構建該丙酮丁醇梭菌的構建方法，以及該菌株的一種新用途。

本發明的目的是這樣實現的：

本發明所提供的菌株為丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)p1147(CGMCCNo3686)。

本發明所提供的丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)為丙酮丁醇梭菌p1147(CGMCCNo3686))于2010年3月22日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCNo3686。

本發明所提供丙酮丁醇梭菌p1147(CGMCCNo3686)是由丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridium?acetobutylicum)ATCC?824(以下簡稱ATCC?824)的原生質體融合而成。

本發明方法是采用原生質體技術構建成丙酮丁醇梭菌p1147(CGMCCNo3686)，故其具有生長快、繁殖量大、周期短，菌株穩定等諸多優點。

本發明所選用的ATCC824可從商業渠道獲得。

本發明在此提供一種優選的丙酮丁醇梭菌p1147(CGMCCNo3686)的構建方法，它包括以下步驟：

a、原生質體的制備

離心收集厭氧培養的ATCC824，使用終濃度為4mg/ml～10mg/ml的溶菌酶酶解30min～40min，55℃～60℃30min～40min加熱致死其原生質體；

b、再生、融合

將a步工序中致死的原生質體，加入5～10mlPEG4000～PEG6000對原生質體誘導融合5～10min，離心收集，加入終濃度為50～60mM的Ca²⁺、和75mMMg²⁺溶液，將菌體混勻，均勻涂布于SRA固體平板上，厭氧箱中培養；

c、融合子的篩選

洗下再生的梭菌，取接種到液體梭菌培養基中，35～38℃厭氧培養48h～72h，離心收集菌體，涂布與玉米平板，37℃厭氧培養3～4d，挑取單菌落至6％淀粉醪糟種子培養基中，37℃培養24h～48h，取1mL轉接8％淀粉發酵培養基，37℃培養48h～72h，選出發酵速度快的丙酮丁醇梭菌p1147(CGMCCNo3686)。

在上述的方法中，玉米淀粉培養液為更優選的淀粉培養液。

玉米淀粉培養液中玉米淀粉占培養液質量百分含量的7.5％，其培養效果更優。

丙酮丁醇梭菌p1147可用于產生含有異丙醇的混合醇。其具體的方法是：