[發明專利]麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重組蛋白制備方法

無效

• 申請號: 201010161333.4
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101880681A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 茍興華;王衛;李德華;劉達玉;張佳敏;郭秀蘭;唐仁勇;胡海洋
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/11;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N9/24;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 伍孝慈

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種人工合成改造的麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列及其重組蛋白的制備方法。

背景技術

海藻糖[α-D-葡萄糖-(1，1)-α-D-葡萄糖苷]是一種廣泛存在于低等植物、藻類、細菌、真菌、酵母和昆蟲等的具有多種功能的非還原性二糖。在自然界中，海藻糖既是一種貯藏性糖類，又是應激代謝的重要產物，具有保護生物細胞和生物活性物質在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環境條件下活性免遭破壞的功能。海藻糖還具有良好的保濕性能，其甜度只有蔗糖的一半，且無還原性醛基，因此海藻糖被廣泛應用于食品和飲料的冷凍和保藏、用作化妝品的保濕劑以及藥物的穩定劑等，在生物制品和食品行業的用途越來越廣泛。由于它具有獨特的功能，吸引科研人員對其進行了大量的研究。早期是從生物體內提取海藻糖，但成本太高，無法進行大規模的生產，阻礙了其大規模的應用。但是后來，科學家Kato從高溫菌株Sulfolobus?solfataricus?KM1中分離到了麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)兩個酶，在這兩個酶的作用下，以淀粉為原料，可分解轉化為海藻糖。用此方法生產海藻糖具有成本低，效率高，是最有競爭力的方法。目前科研人員對兩個酶進行了基因克隆和重組表達，但在大腸桿菌表達這兩個酶的效果均不理想，限制了酶法途徑在海藻糖合成中的運用。

基于此，發明人在分析了MTHase基因密碼子的成分后，以芝田硫化葉菌(Sulfolobusshibatae)B12嗜熱嗜酸古細菌MTHase基因(GeneBank：AF201335)為基礎，優化密碼子結構，合成酵母偏愛密碼子和修改基因遺傳密碼子中的A/T含量，得到了一條基因密碼子結構得到優化，A/T含量降低的MTHase基因序列，利用酵母表達系統的優點，將完整的MTHase基因克隆到酵母表達載體pPICZαA，篩選出重組載體并將其導入Pichia?pastoris細胞進行重組表達。獲得了一株高效穩定表達MTHase的酵母菌株，分泌到表達培養基上清中的MTHase的酶活大于800mg/L，為工業化用酶法以淀粉為原料生產海藻糖打下基礎。

發明內容

鑒于以上所述，本發明的一個目的是通過人工合成改造麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因，使其基因密碼子結構得到優化，A/T含量降低，提供一種優化的編碼這種酶的多核苷酸序列。因此，本發明涉及這樣一種經人工合成改造的多核苷酸序列，該序列選自SEQ?ID?NO：4中的序列，其全長為1683bp，編碼559個氨基酸殘基。本發明還涉及用于人工合成改造該基因的全部引物序列。

本發明的另一個目的是提供含有編碼這種麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的重組表達質粒。

本發明的另一個目的是提供含有編碼這種麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的基因工程化的宿主細胞。

本發明的另一個目的是通過基因工程化宿主細胞，建立這種酶的重組表達制備方法。

本發明另外涉及一種含有本發明多核苷酸的重組表達質粒；一種用該重組表達質粒進行基因工程化的宿主細胞；一種包括培養所述宿主細胞和重組表達該酶的方法。

本發明也涉及包含本發明直接用該人工改造基因經過基因工程方法產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶的方法。

本發明中，編碼麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發明所述多核苷酸的重組表達質粒。術語“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于pPICZαA。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用于構建重組表達質粒。

本發明中，編碼的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組表達質粒可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組表達質粒的基因工程化宿主細胞。術語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，入哺乳動物細胞。代表性的例子有：大腸桿菌、酵母細胞和動物細胞如CHO、COS等。

用本發明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組表達質粒轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物，如大腸桿菌等，可采用本領域眾所周知的方法和電轉化方法進行。當宿主為酵母細胞時，一般采用電轉化方法。