[發(fā)明專利]一種家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A的方法及其制藥用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010161096.1
• 申請(qǐng)日: 2010-04-23
• 公開（公告）號(hào): CN101845442A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 貢成良;陸葉;鄭小堅(jiān);薛仁宇;曹廣力
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/24
• 分類號(hào): C12N15/24;C12N15/866;C07K14/54;A61K38/20;A61P31/12;A61P35/00;A61P37/02
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 陶海鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A的方法及其制藥用途。

背景技術(shù)

人白細(xì)胞介素(interleukin)28A(hIL-28A)是一種新型的干擾素λ(IFN-λ)，與I類干擾素(IFN)的功能類似，具有抗病毒、抗增殖及免疫調(diào)節(jié)等活性。人自然白介素是通過分別刺激淋巴母細(xì)胞和人體白細(xì)胞，然后提純制備而得。目前市場(chǎng)供應(yīng)的只有由類淋巴母細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素，是天然的多亞型的混合物。臨床用的主要是重組制劑，劑型主要有粉劑和水劑，無口服劑型，使用均為注射給藥。

家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Bombyx?mori?baculovirus?expressionvector?system)是真核表達(dá)系統(tǒng)，已有許多基因在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。用該系統(tǒng)在家蠶中表達(dá)外源基因，表達(dá)水平高、產(chǎn)物生物活性好。

目前，未見利用家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)人白細(xì)胞介素(interleukin)28A的報(bào)道，以及關(guān)于人白細(xì)胞介素(interleukin)28A口服制劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種利用家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利用家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A的方法，通過基因工程方法獲得重組的帶有人白介素28A(hIL-28A)基因的家蠶Bombyx?mori桿狀病毒，并用該病毒接種家蠶幼蟲或蛹，使人白介素28A在家蠶幼蟲或蛹中獲得高效表達(dá)。將高效表達(dá)人白介素28A的幼蟲或蠶蛹制備成口服制劑，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明具有顯著的抗腫瘤作用。

上述技術(shù)方案中，所述重組的帶有人白介素28A(hIL-28A)基因的家蠶Bombyx?mori重組桿狀病毒的制備方法為：

(1)根據(jù)GenBank已公開的hIL-28A的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：BC113583)，合成hIL-28A基因的編碼序列，克隆進(jìn)T-載體，獲pUC-hIL-28A質(zhì)粒；

(2)用BamH?I/EcoR?I雙酶切消化pUC-hIL-28A質(zhì)粒回收hIL-28A基因片段，用BamH?I/EcoR?I雙酶切消化供體質(zhì)粒pFastBac-Dual回收pFastBac-Dual片段，將hIL-28A基因片段插入到pFastBac-Dual的BamH?I和EcoR?I之間，將hIL-28A克隆進(jìn)pFastBac-Dual載體中的桿狀病毒多角體基因啟動(dòng)子下游獲得pFastBac-Dual-hIL-28A重組質(zhì)粒；

其中，質(zhì)粒pFastBac-Dual是美國(guó)Invitrogen公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品名為PFASTBAC-DUAL?EXP?VECTOR；pFastBac-Dual載體屬于Bac-to-Bac(Bacteria?to?Baculovirus)表達(dá)系統(tǒng)，

(3)將pFastBac-Dual-hIL-28A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BmDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取重組Bacmid基因組Bacmid-hIL-28A?DNA；

(4)將Bacmid-hIL-28A?DNA由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN，培養(yǎng)細(xì)胞后取上清，獲得重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A。

上述技術(shù)方案中，采用所述家蠶Bombyx?mori重組桿狀病毒接種家蠶幼蟲或蛹的方法為：將重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN進(jìn)行擴(kuò)增，采用擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A接種至五齡家蠶幼蟲或蛹。進(jìn)一步地，取5天后家蠶或蛹的血淋巴，分析檢測(cè)hIL-28A表達(dá)水平，結(jié)果顯示每毫升血淋巴中重組hIL-28A的量達(dá)33μg。

本發(fā)明的另一目的為提供一種含有人白介素28A藥物的制備方法，為實(shí)現(xiàn)該目的，采用的技術(shù)方案為，一種含有人白介素28A藥物的制備方法，采用上述技術(shù)方案獲得的感染重組家蠶桿狀病毒的家蠶幼蟲或蛹經(jīng)冷凍干燥后制成口服藥物制劑；經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)表明具有顯著的抗腫瘤作用。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：