[發明專利]一種產β-D-半乳糖苷酶的菌株及用該酶生產低聚半乳糖的方法

有效

• 申請號: 201010160761.5
• 申請日: 2010-04-19
• 公開（公告）號: CN101831389A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 江波;繆銘;張濤;劇淑君
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N9/38;C12P19/14;C12R1/645
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及能夠生產β-D-半乳糖苷酶的一種新微生物菌株及其培養發酵生產β-D-半乳糖苷酶，并將該酶用于生物制備低聚半乳糖的方法，屬于食品生物技術領域。更具體的說本發明涉及來源于土壤的克魯維酵母(Kluyveromycessphaeroides)SK?16.001，保藏編號為CCTCC?NO：M?2010073，它能夠產生β-D-半乳糖苷酶，并利用該酶催化乳糖合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides)。

背景技術

近年來，功能食品成為廣大消費者關注的熱點，更是廣大食品從業者研發的焦點。糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低齡化，使得低熱量、具有更多功能營養特性的功能性甜味劑成為關注的熱點。

低聚半乳糖是由半乳糖基和葡萄糖基構成的聚合度為2～6的寡糖，低聚半乳糖具有甜度低，水分活度低，對酸、熱穩定等理化性質。低聚半乳糖還具有非致齲齒性、非消化性(具有類似膳食纖維的生理功能)、促進腸道雙岐桿菌增殖等功能。

因此，低聚半乳糖作為一種功能性食品添加劑廣泛應用于乳制品、糖果、罐頭等食品。

酶法合成是工業化生產低聚半乳糖的主要途徑。β-D-半乳糖苷酶屬于水解酶類，同時具有轉移酶類性質。一方面，β-D-半乳糖苷酶可以催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，另一方面，還可以催化半乳糖基轉移至乳糖等受體上的轉移反應。

酶法合成低聚半乳糖的產率受多種因素影響，酶的來源直接影響酶法合成的低聚半乳糖的結構和產率。迄今為止，已發現多種微生物可以產生此酶，其中主要集中在米曲霉(A.Oryzae)、黑曲霉(A.niger)和乳酸克魯維酵母(K.lactis)。

本發明人深入調查和研究了現有技術并對各種高收率生產低聚半乳糖的方法進行了研究，最終我們篩選到一株能產生β-D-半乳糖苷酶的新微生物，證明了通過此酶與高濃度的乳糖反應能得到高轉化率的低聚半乳糖，并通過濃縮干燥等手段得到低聚半乳糖的糖漿或粉末。基于上述發現提出了本發明。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的微生物，它能夠生產高酶活的β-D-半乳糖苷酶。

本發明的另一個目的是提供一種該β-D-半乳糖苷酶與高濃度乳糖溶液反應的方法，以得到高轉化率的低聚半乳糖。

本發明的再一個目的是提供一種低聚半乳糖提純與精制的方法，以得到高低聚半乳糖糖漿或粉末。

為了實現上述目的，本發明提供一種來源于土壤的克魯維酵母(Kluyveromyces?sphaeroides)SK?16.001，其為能夠產生β-D-半乳糖苷酶的菌株，并利用該β-D-半乳糖苷酶轉化乳糖生成低聚半乳糖。

本發明的技術方案：一株產β-D-半乳糖苷酶的菌株，其分類命名為克魯維酵母(Kluyveromyces?sphaeroides)SK?16.001，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?2010073。

用所述的微生物克魯維酵母SK?16.001，即CCTCC?NO：M?2010073菌株發酵生產β-D-半乳糖苷酶的方法，步驟為：

(1)種子培養

種子培養基：酵母膏1-10g/L，蛋白胨1-20g/L，葡萄糖1-40g/L，pH5.5-8.0，去離子水配制；

種子培養條件：菌株于28-30℃、100-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養10-20h來活化該微生物；

(2)發酵培養

發酵培養基：酵母膏1-20g/L，蛋白胨1-20g/L，乳糖1-30g/L，pH5.5-8.0；

發酵條件：25-30℃、攪拌速度400-700rpm、空氣流量0.5-1.0vvm的條件下在發酵培養基中發酵10-48h生產β-D-半乳糖苷酶；

(3)發酵后處理

發酵液經冷凍離心后收集濕菌體，用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，然后菌體細胞破壁提取出β-D-半乳糖苷酶。冷凍離心后，收集的上清液即為粗酶液，經檢測酶活達到2-100U/mL；

所得粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到β-D-半乳糖苷酶的粗酶粉。