[發(fā)明專利]BRAF基因突變檢測特異性引物和液相芯片

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010160760.0
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN102234684A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許嘉森;李國強(qiáng);余剛;秦會(huì)娟
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州益善生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及BRAF基因突變檢測特異性引物和液相芯片。

技術(shù)背景

鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(v-taf?mourine?sarcoma?viral?oncogene?homolog?B1，BRAF)基因，定位于人染色體7q34，其具有功能的編碼區(qū)由2510對堿基組成，編碼MAPK通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，該酶將信號從Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2，從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。研究表明，BRAF主要有兩種突變類型：①11％的突變位于外顯子11上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等點(diǎn)突變；②89％的突變發(fā)生于外顯子15上的激活區(qū)，其中約92％位于第1799位核苷酸上(T突變?yōu)锳)，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。

目前，已經(jīng)建立的BRAF基因突變檢測技術(shù)，主要是PCR-測序法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)。PCR-測序法具有能夠確定突變范圍和類型的優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用較為廣泛的檢測方法，但測序法的靈敏度只有20％-25％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，尤其是對于異質(zhì)性的腫瘤體細(xì)胞突變，低靈敏度將導(dǎo)致大量的漏檢。同時(shí)，測序法檢測操作復(fù)雜，時(shí)效性差，對于要求高時(shí)效性和高靈敏度實(shí)際應(yīng)用檢測，測序法的局限性早已凸顯。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，其檢測效率高，時(shí)效性強(qiáng)，但其高居不下的假陽性率也為實(shí)際應(yīng)用所詬病。基于上述檢測技術(shù)存在的問題，申請人前期成功開發(fā)的“BRAF基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法”(申請?zhí)枺?00910037357.6)檢測方法操作簡單，通過酶切富集排除了大量野生型序列造成的干擾，結(jié)果特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確度達(dá)99％以上，但該方法涉及兩輪PCR操作，較易造成污染，且雜交檢測步驟探針較為接近(只有突變位點(diǎn)不同)，不便于多種基因突變位點(diǎn)并行檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供BRAF基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測BRAF基因的正常基因型和V600E突變型。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

一種BRAF基因突變檢測液相芯片，主要包括有，

(A)針對BRAF的V600E突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的一對ASPE引物：每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物組成，所述tag序列選自SEQID?NO.25-SEQ?ID?NO.30中的任2種序列；所述特異性引物是來源于SEQ?ID?NO.1和SEQ?IDNO.2或其反向互補(bǔ)序列SEQ?ID?NO.13和SEQ?ID?NO.14中的堿基序列，且特異性引物的3’端的最后3位堿基中的一個(gè)堿基為突變位點(diǎn)，所述特異性引物的Tm值在52～58℃之間；

(B)分別包被有特異的anti-tag序列的、具有不同顏色編碼的2種微球，所述anti-tag序列選自SEQ?ID?NO.31～SEQ?ID?NO.36中的序列，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；

(C)用于擴(kuò)增具有V600E突變位點(diǎn)的BRAF基因目標(biāo)序列的擴(kuò)增引物。

優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物為SEQ?ID?NO.37和SEQ?ID?NO.38。

優(yōu)選地，所述野生型的特異性引物為SEQ?ID?NO.3～SEQ?ID?NO.7中的一條，所述突變型的特異性引物為SEQ?ID?NO.8～SEQ?ID?NO.12中的一條；或所述野生型的特異性引物為SEQID?NO.15～SEQ?ID?NO.19中的一條，所述突變型的特異性引物為SEQ?ID?NO.20～SEQ?IDNO.24中的一條。

優(yōu)選地，所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用于BRAF基因突變檢測的特異性引物。

具體技術(shù)方案如下：

用于BRAF基因V600E突變檢測的特異性引物，所述特異性引物是來源于SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2或其反向互補(bǔ)序列SEQ?ID?NO.13和SEQ?ID?NO.14中的堿基序列，且特異性引物的3’端的最后3位堿基中的一個(gè)堿基為突變位點(diǎn)，所述特異性引物的Tm值在52～58℃之間。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：

1.本發(fā)明所制備的BRAF基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的并行檢測。