[發明專利]一種發酵制備2-KGA的營養強化培養基及其制備2-KGA的方法

有效

• 申請號: 201010160178.4
• 申請日: 2010-04-30
• 公開（公告）號: CN101845475A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 儀宏
• 申請（專利權）人: 儀宏
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P7/60;C12R1/01;C12R1/02;C12R1/07
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所屬領域：

本發明涉及發酵工程與生物技術領域內的一種培養基，尤其是一種發酵制備2-KGA的營養強化培養基，同時本發明還涉及一種應用該強化培養基制備2-KGA的方法。

背景技術

2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic?acid，簡稱2-KGA)是制備維生素C(L-抗壞血酸)的重要前體。目前工業上主要采用“二步發酵法”工藝。該工藝需要經過兩步發酵過程：第一步發酵，以D-山梨醇為底物，經醋酸菌Acetobacter?sp.發酵，獲得L-山梨糖，第二步發酵，以L-山梨糖為底物，經生酮基古龍酸菌Ketogulonigenium?vulgare(俗稱小菌)和芽孢桿菌Bacillussp(俗稱大菌)兩種微生物的混合發酵，獲得2-KGA。第一步發酵與第二步發酵聯合起來形成了由山梨醇到2-KGA的“二步發酵法”工藝。

“二步發酵法”工藝的主要特點是在“第二步發酵”過程中，由于芽孢桿菌Bacillus?sp(俗稱大菌)的伴生，普通生酮基古龍酸菌Ketogulonigeniumvulgare(俗稱小菌)的生長和2-KGA的產率得到很大提高。混合菌中的大菌沒有任何產生2-KGA的能力，其主要作用是輔助小菌生長，小菌是2-KGA的產生菌，大菌對小菌生長和產酸的作用機理仍然沒有搞清楚。

本發明通過建立高通量的發酵評價技術平臺，對可能輔助小菌生長和產酸的營養物質進行了大規模篩選，首先發現了谷胱甘肽對于小菌產酸的活性，并將這一發現共享給天津大學，天津大學做了后續研究，發現了含巰基化合物對小菌的生長刺激作用，并申請了專利(200910069697.7)。隨后發現，原兒茶酸(3，4-二羥基苯甲酸)具有刺激小菌生長產酸的活性.進一步又發現琥珀酸、L-蘋果酸、延胡索酸、草酰乙酸，具有明顯促進小菌生長和產酸的功能，其促進作用達到或超越了芽孢桿菌的伴生效果。總結這些化合物的特征，與三羧酸循環關系密切四碳二羧酸效果較好，但是，除了這些四碳二羧酸之外，含有一些有機物，例如原兒茶酸，丁二醇，也具有促進小菌生長和產酸的活性。

(1)琥珀酸，又稱1，4-丁二酸，分子式C₄H₆O₄，分子量118，白色結晶或結晶粉末，是一種具有廣泛用途的有機化工原料，主要用于制備琥珀酸酐、醇酸樹脂、油漆、染料、食品調味劑等，醫藥工業中可用它生產磺胺藥、維生素A、維生素B等抗痙攣劑、松痰劑、利尿劑和止血藥物，還可用于生產潤滑劑和表面活性劑的原料。在生物體內，琥珀酸是三羧酸循環的重要中間產物，經由α-酮戊二酸脫羧、或者異檸檬酸裂解而來，琥珀酸脫氫可形成延胡索酸。

(2)延胡索酸，又稱反丁烯二酸、富馬酸，分子式C₄H₆O₄，分子量116，無色晶體，用于生產不飽和聚酯樹脂、粘合劑、增塑劑等，是精細化學品的中間體，在醫藥工業中用于解毒藥二巰基丁二酸、反丁烯二酸鐵的生產，也可作為一種食品添加劑。在生物體內，延胡索酸是三羧酸循環的重要中間產物，它來自琥珀酸的脫氫，經過水合后產生L-蘋果酸。

(3)蘋果酸，又稱2-羥基丁二酸，分子式C₄H₆O₅，分子量134，由于分子中有一個不對稱碳原子，有兩種立體異構體。自然界中以D-蘋果酸、L-蘋果酸和DL-蘋果酸三種形式存在。最常見的是L-蘋果酸，存在于不成熟的的山楂、蘋果和葡萄果實的漿汁中，易被人體吸收。L-蘋果酸可用于食品添加劑、化妝品、保健品、飼料添加劑等，也可用于治療肝病、貧血等多種疾病。在生物體內，L-蘋果酸是三羧酸循環的重要中間產物，由延胡索酸水合后產生，經脫氫后形成草酰乙酸。

(4)草酰乙酸，又稱2-氧代丁二酸，2-羰基丁二酸，分子式C₄H₄O₅，分子量132，是三羧酸循環的一個中間產物。可以在蘋果酸脫氫酶的催化下由蘋果酸生成，或在丙酮酸羧化酶的作用下，由丙酮酸與CO₂生成，另外，也在轉氨酶(EC2.6.1.1)的作用下由天冬氨酸生成，目前主要用于化學試劑。