[發明專利]生物轉化制備4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法

有效

• 申請號: 201010159808.6
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101831479A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 袁其朋;李立光;梁浩;谷友剛
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P19/64
• 分類號: C12P19/64;C12R1/645;C12R1/685;C12R1/745
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本發明涉及一種重要的活性物質前體4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的生物轉化制備的方法，屬于生物轉化技術領域。

背景技術

萊菔硫烷(sulforaphane)是迄今為止從蔬菜中發現的最具抗癌活性的化合物，大量研究證明，萊菔硫烷對食道癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等都有很好的預防效果。其前體物4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要存在于十字花科蔬菜西蘭花種子當中。目前，萊菔硫烷主要是通過水解西蘭花種子中的4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，然后經過分離純化制備而得。

目前，4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷主要通過天然產物提取的方法獲得：將十字花科植物西蘭花種子高溫滅酶，以沸水或醇水體系作回流提取溶劑，將提取液過濾蒸干得到硫代葡萄糖苷粗提物，制備高純度硫代葡萄糖苷，可采用酸性氧化鋁色譜柱、大孔強堿性陰離子交換樹脂以及制備色譜等技術進一步除雜純化。

在所有十字花科植物種子中，4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷在西蘭花種子中含量最高，但西蘭花種子價格比較昂貴，原料成本較高，嚴重限制工業化生產。萊菔子容易獲得且價格低廉，其價格是西蘭花種子的三十分之一。其主要硫甙4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷的側鏈結構為直鏈烷基，與4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷結構相似，僅在3、4位相差一個C＝C。所以由4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷向4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的轉化工藝將會大大減少生產萊菔硫烷的生產成本，可促進萊菔硫烷的工業化生產的實現。

現有技術中，已有一項美國專利7,371,419中報道，通過對從萊菔子中提取得到的4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷粗品進行化學合成催化加氫也生成了4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷，該方法使用的高壓反應釜作為反應容器，鈀碳等作為化學催化劑，并通入氫氣，在高壓環境下進行多次化學合成反應。由于4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷在高壓下極易分解變質，導致催化效率波動范圍較大，反應不穩定，重復性較差，且該反應對設備耐壓耐熱要求較高，能耗高，存在大量的副反應。

發明內容

本發明為克服上述缺點，提出采用生物催化生成4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，取代原有化學催化。該方法工藝簡單，反應條件溫和，易于工業化生產。其反應式如下：

1：4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷

2：4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一種生物轉化制備4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，所述方法包括：在以4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷為底物、以面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢中的一種菌種的發酵產物為酶源的反應體系中，于溫度25-35℃下進行生物轉化，反應結束后轉化液經分離純化得到所述的4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷；所述發酵產物為所用菌種經發酵獲得的發酵液或濕菌體；可將濕菌體加入含有底物4-(甲基亞硫酰基)-3-丁烯基硫代葡萄糖苷底物的緩沖溶液中作為反應體系，或直接按需要量將底物加入發酵液中作為反應體系。

所述的微生物催化合成4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法，其特征在于所述菌種為面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢。

所述發酵液或者濕菌體由如下方法制備得到：將面包酵母、深紅酵母、白地霉、白僵霉、黑曲霉、束梗頭孢其中一種接種至發酵培養基，于該菌體常規適宜生長溫度下培養16～48小時后，得發酵液，將發酵液于5000r/min離心10分鐘得到濕菌體。所述發酵培養基為常規適用于該菌種的液體發酵培養基。

所述反應體系中底物初始濃度為10-100mg/ml，發酵產物加入量以所含濕菌體的濕重計為50～400g/l。濕重法系單位體積培養物經離心后將濕菌體進行稱重。

所述反應體系中添加有終濃度為10-100g/L的葡萄糖作為輔助底物，可以促進反應進行。

優選的，所述反應體系的溶劑為0.1M，pH8.0的磷酸鹽緩沖液，將底物和濕菌體加入磷酸鹽緩沖液中，作為反應體系。

所述對稱還原反應的反應溫度為25～35℃，反應時間為24～120小時，在此條件下所得的轉化液進行液相色譜、質譜分析測定表明，轉化產物主要組分4-甲基亞硫酰基丁基硫代葡萄糖。

所述的具體實驗方法如下：

(1)斜面培養：適用于所用菌種的斜面培養基接種該菌株，30℃斜面培養3～5天，作為斜面種子；