[發明專利]一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產品

有效

• 申請號: 201010159741.6
• 申請日: 2010-04-29
• 公開（公告）號: CN101816785A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 李玉和;沈明君;范娟;季明;潘杰
• 申請（專利權）人: 揚州優邦生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 樊文紅

技術領域

本發明涉及一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產品，屬于生物工程技術領域。

背景技術

通常禽源病毒繁殖主要采用雞胚繁殖法和細胞培養法，而禽流感病毒因無法直接在細胞中 生產繁殖，仍然采用雞胚繁殖法，通過將病毒接種在雞胚基質中，在雞胚生長過程中，病毒復 制，達到大量生產病毒的目的，是一種類似于自然生物環境條件下繁殖病毒的方法。雞胚繁殖 法簡單易行，不需對病毒進行處理、馴化，分離毒可直接接種雞胚。但生產需要大量雞胚，收 獲病毒液后，需對剩余雞胚進行無害化處理，且易于感染禽源外源病毒，產生生物安全隱患。

病毒繁殖的另一種常用的方法是細胞繁殖法，將病毒接種于已擴增的動物細胞內，保持細 胞活性，通過病毒在細胞間的不斷感染和復制，來達到大量擴增病毒的目的。但禽流感病毒直 接接種細胞不能感染、增殖。隨著研究的深入開展，在二十世紀90年代有研究人員發現在繁殖 禽流感病毒時，加入適量的胰酶有助于病毒的增殖，但病毒滴度無法達到生產要求。然而，在 生產病毒時，大量、高密度生長良好的細胞是生產高滴度病毒的前提，因此如何解決這一矛盾 是細胞培養禽流感病毒成功的關鍵。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于解決禽流感病毒細胞繁殖難，而目前禽流感生產大量使用 雞胚又常常導致生物安全隱患的問題，提供一種安全連續封閉式細胞培養病毒生產的方法及產 品，使該疫苗的生產能夠不再依賴雞胚繁殖而降低生物安全隱患，同時使用該細胞培養方法也 能生產出高滴度的病毒，滿足免疫生產要求，在發生疫情時，能夠快速提供疫苗。

本發明將通過以下技術方案實現：

一、一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)病毒適應細胞系MDCK細胞的馴化

將病毒適應細胞系MDCK細胞進行無載體培養的馴化，改變其貼壁生長的特性，使其適應 全懸浮培養的生長環境；

其中，所述的無載體培養馴化方法為：將復蘇后經2～3代貼壁培養的MDCK細胞胰酶消 化后，按2×10⁵cells/mL密度加入三角搖瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培養基搖床培養， PH?7.1～7.5，40～48小時后，待細胞密度達1～5×10⁶cells/mL時，分瓶傳代，同時觀察細胞形 態，每次傳代選取細胞形態良好的搖瓶分瓶傳代，按上述方法搖床培養，連傳43代，分裝，液 氮凍存；

(2)MDCK細胞的初級擴增培養

將馴化完成的MDCK細胞向細胞培養生物反應器中接種1～5×10⁵cells/mL的細胞，懸浮培 養，直至擴增至0.3～1×10⁷cells/mL，實現細胞初級擴增培養；

其中，所述的培養基為：含6～10％血清的F-DMEM培養基；

所述的培養條件為：溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃、初級流加速率6L/ 天，穩定后流加速率3L/天；

(3)病毒適應細胞的連續培養

初級擴增培養結束后，在上述細胞培養生物反應器中流加新鮮培養基和泵出細胞懸浮液， 以維持生物反應器穩定的同時，保證細胞在反應器中停留時間內擴增至0.3～1×10⁷cells/mL，實 現細胞連續培養；

其中，所述的培養基為：流加培養基為懸浮MDCK的無血清NF-DMEM培養基；

所述的培養條件為：溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃、流加速率3L/天；

(4)接種病毒培養制備病毒液

將馴化的已適應細胞繁殖的H9N2亞型禽流感分離株JY株病毒接種于懸浮細胞，改變培養 因素，隨著細胞懸浮液的不斷流入和病毒上清液以同樣速度的不斷流出，在維持系統動態平衡 的過程中實現病毒的連續增殖，使病毒適應在懸浮培養細胞中擴增病毒含量≥10⁷TCID₅₀/mL，即 血凝價HA≥2⁸；

其中，所述的改變的培養因素為：溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、溫度32～36℃、流加培 養基為懸浮MDCK的含1.2～1.6μg/mL胰酶無血清培養基、流加速率2L/天；

(5)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產品

其中，病毒液的濃縮及滅活方法為：