[發明專利]一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產品

有效

• 申請號: 201010159741.6
• 申請日: 2010-04-29
• 公開（公告）號: CN101816785A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 李玉和;沈明君;范娟;季明;潘杰
• 申請（專利權）人: 揚州優邦生物制藥有限公司
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 樊文紅

1.一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)病毒適應細胞系MDCK細胞的馴化

將病毒適應細胞系MDCK細胞進行無載體培養的馴化，改變其貼壁生長的特性，使其適應 全懸浮培養的生長環境；所述的無載體培養馴化方法為：將復蘇后經2～3代貼壁培養的MDCK 細胞胰酶消化后，按2×10⁵cells/mL密度加入三角搖瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培養基 搖床培養，PH?7.1～7.5，40～48小時后，待細胞密度達1～5×10⁶cells/mL時，分瓶傳代，同時 觀察細胞形態，每次傳代選取細胞形態良好的搖瓶分瓶傳代，按上述方法搖床培養，連傳43代， 分裝，液氮凍存；

(2)MDCK細胞的初級擴增培養

將馴化完成的MDCK細胞向細胞培養生物反應器中接種1～5×10⁵cells/mL的細胞，懸浮培 養，直至擴增至0.3～1×10⁷cells/mL，實現細胞初級擴增培養；所述的培養基為含6～10％血清 的F-DMEM培養基；所述的培養條件為：溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃；

(3)病毒適應細胞的連續培養

初級擴增培養結束后，在上述細胞培養生物反應器中流加新鮮培養基和泵出細胞懸浮液， 以維持生物反應器穩定的同時，保證細胞在反應器中停留時間內擴增至0.3～1×10⁷cells/mL，實 現細胞連續培養；所述的流加的培養基為懸浮MDCK的無血清NF-DMEM培養基；所述的培養 條件為：溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃；

(4)接種病毒培養制備病毒液

將馴化的已適應細胞繁殖的H9N2亞型禽流感分離株JY株病毒接種于懸浮細胞，改變培養 因素，隨著細胞懸浮液的不斷流入和病毒上清液以同樣速度的不斷流出，在維持系統動態平衡 的過程中實現病毒的連續增殖，使病毒適應在懸浮培養細胞中擴增病毒含量≥10⁷TCID₅₀/mL，即 血凝價HA≥2⁸；所述的改變的培養因素為：溶氧40～60％、PH值7.0～72、溫度32～36℃、流 加培養基為懸浮MDCK的含12～1.6μg/mL胰酶無血清培養基；

(5)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產品。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)的病毒液的濃縮及滅活 方法為：收集步驟(4)得到的病毒液，預處理后經30KD截流分子量的膜包濃縮至病毒HA血 凝效價≥2⁹時，停止濃縮，采用甲醛溶液滅活，使滅活劑終濃度為0.1％，37℃滅活16小時。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)的將濃縮及滅活后病毒 液制備成疫苗產品的方法為：

油相制備：取注射用白油94份，加硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加 入司本-806份，混合后，高壓滅菌備用；

水相制備：取濃縮后滅活的病毒液96份，加入滅菌的吐溫-804份，充分搖動，直到吐溫 -80完全溶解；

乳化：取油相3份置于乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相1份，持續攪拌30～60分鐘， 攪拌速度800r/min，后通過剪切機2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成H9N2亞型禽流感滅 活疫苗；

檢測：取樣5～10mL，以3000r/min離心15分鐘，如有分層現象，應重復乳化1次。

4.根據權利要求1所述的H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產品。