[發(fā)明專利]一種抗雙酚A單克隆抗體的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010157470.0
• 申請(qǐng)日: 2010-04-21
• 公開（公告）號(hào): CN101863981A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙肅清;黃洪;張磊;張焜;李明月;鄭杰;方巖雄;黃寶華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;C07K14/765;C12N5/20;G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

1.一種抗雙酚A單克隆抗體的制備方法，其特征在于首先合成出雙酚A半抗原，再將雙酚A半抗原分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白歐聯(lián)，得到人工免疫抗原和人工包被抗原；將雙酚A人工免疫抗原免疫小鼠制備脾細(xì)胞懸液，在聚乙二醇作用下融合小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，經(jīng)雜交瘤技術(shù)檢測和多次亞克隆后得到能穩(wěn)定分泌雙酚A抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙酚A單克隆抗體的制備方法，其特征在于具體的制備步驟如下：

1)雙酚A人工免疫抗原和包被抗原的合成：首先對(duì)雙酚A進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，引入羧基基團(tuán)，采用碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺混合法將結(jié)構(gòu)修飾了的雙酚A分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白偶聯(lián)制備雙酚A人工免疫抗原和包被抗原；

2)雙酚A單克隆抗體細(xì)胞株的制備及篩選：用合成的雙酚A人工免疫抗原免疫小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，在質(zhì)量濃度50％聚乙二醇作用下融合小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0并以次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脫氧核苷培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)融合細(xì)胞，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測和間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測出陽性雜交瘤細(xì)胞，再經(jīng)過多次有限稀釋克隆后得到的陽性雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌雙酚A抗體；

3)雙酚A單克隆抗體的制備純化：用擴(kuò)增培養(yǎng)后的陽性雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生腹水，收集小鼠腹水并用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水得到了雙酚A單克隆抗體，聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測純化后抗體的純度；

4)雙酚A單克隆抗體的鑒定：陽性雜交瘤細(xì)胞分泌的雙酚A單克隆抗體，經(jīng)鼠單克隆抗體亞類試紙檢測結(jié)果表明屬于IgG1亞類，其輕鏈為Kappa；間接ELISA和間接競爭ELISA證實(shí)該類抗體只與雙酚A有特異性結(jié)合，而不與載體蛋白反應(yīng)，表明單克隆細(xì)胞分泌的抗體是特異性抗雙酚A的。