[發(fā)明專利]一個大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010156259.7
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101805740A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃方;喻德躍;遲英俊
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一個大豆MADS-box基因GmMADS1的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人們已經(jīng)從處于不同進(jìn)化地位的整個龐大的植物各類群中分離得到了大量的MADS-box基因，MADS-box基因在花發(fā)育中起著重要作用，無論是從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)換；還是在生殖生長的初始階段，花分生組織決定基因啟動花分生組織的發(fā)育；以及在生殖生長后期，花器官原基的發(fā)育中都發(fā)揮著重要的作用。

大豆作為重要的糧油作物，有關(guān)其花發(fā)育的研究還相對滯后。大豆花多，花器較小，花粉粘重，花朵開放時翼瓣和龍骨瓣緊緊包住雄蕊和柱頭，花藥和柱頭不外露，異花間的風(fēng)媒傳粉等花器特點造成大豆異花傳粉非常難，也使大豆雜種優(yōu)勢很難利用，如果能定向改變大豆的花器結(jié)構(gòu)，使之更利于吸引傳粉昆蟲或有利于風(fēng)媒傳粉，這將大大降低不育系繁殖或雜交制種的成本，使大豆雜交種應(yīng)用于大面積生產(chǎn)。Feng(2006)通過對LjCYC2的遺傳操作，在百脈根中已經(jīng)實現(xiàn)對花瓣的改造。對大豆這樣的嚴(yán)格自花授粉作物而言，或許可以以基因操作為基礎(chǔ)的分子設(shè)計，實現(xiàn)其傳粉方式的改變。因此，弄清花發(fā)育的分子機制，進(jìn)而為改造花器官提供基礎(chǔ)，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本發(fā)明從大豆中克隆了1個與在花瓣位置和數(shù)目的確定性上發(fā)揮了重要的調(diào)控作用的基因GmMADS1，提出了利用該基因進(jìn)行植物花器官改造的基因工程改良方法。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明的目的在于公開大豆MADS-box基因GmMADS1在花器官改造中的基因工程應(yīng)用，該基因可作為目的基因?qū)胫参铮淖冎参锏幕ㄐ停赃M(jìn)行植物品種改良。

技術(shù)方案

本發(fā)明所提供的大豆MADS-box基因GmMADS1，其序列為：SEQ?ID?NO.1。

大豆MADS-box基因GmMADS1的基因工程應(yīng)用，包括：

1)大豆MADS-box基因GmMADS1的克隆

根據(jù)大豆MADS-box基因GmMADS1的全長序列，設(shè)計兩端引物：

上游引物：5′-GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3′

下游引物：5′-CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3′

取大豆品種Jackson花和花芽的混合物，提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序如下：94℃預(yù)變性4分鐘，94℃變性30s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，33個循環(huán)后，72℃10min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆至pMD18-T載體，測序后獲得具有完整編碼區(qū)的大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列SEQ?ID?NO.1；

2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入BamHI限制性內(nèi)切酶位點，下游引物引入SacI限制性內(nèi)切酶位點(單下劃線標(biāo)示的是BamHI的酶切位點；雙下劃線標(biāo)示的是SacI的酶切位點)：

上游引物：5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3

下游引物：5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3

以步驟1)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將GmMADS1的cDNA克隆至中間載體pMD18-T，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體pBI121；

3)轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入植物，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗證后進(jìn)行植物的表型分析，獲得將步驟2)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入煙草，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR，RT-PCR驗證后進(jìn)行植物的表型分析，獲得的GmMADS1轉(zhuǎn)基因植株提前開花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的數(shù)目增加，產(chǎn)生了萼片、雄蕊向花瓣的轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)子房狀萼片、開裂的花瓣和彎曲的雄蕊，而且由于雄蕊彎曲和縮短，導(dǎo)致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADS1轉(zhuǎn)基因植株的花藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株育性下降甚至完全不育。

有益效果