[發明專利]一個大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的應用

無效

• 申請號: 201010156259.7
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101805740A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發明（設計）人: 黃方;喻德躍;遲英俊
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.大豆MADS-box基因GmMADS1的基因工程應用，其序列為SEQ?ID?NO.1，包括：

1)大豆MADS-box基因GmMADS1的克隆

根據大豆MADS-box基因GmMADS1的全長序列，設計兩端引物：

上游引物：5′-GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3′

下游引物：5′-CAAGGAAGAGGCTA?GCTAGG-3′

取大豆品種Jackson花和花芽的混合物，提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈后，進行PCR擴增，PCR程序如下：94℃預變性4分鐘，94℃變性30s，55℃復性1min，72℃延伸2min，33個循環后，72℃10min，將PCR產物進行克隆至pMD18-T載體，測序后獲得具有完整編碼區的大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列SEQ?ID?NO.1；

2)植物表達載體的構建

根據大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入BamH?I限制性內切酶位點，下游引物引入SacI限制性內切酶位點：

上游引物：5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3

下游引物：5-ACAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3

以步驟1)中獲得的PCR擴增產物為模板，經PCR擴增后，將GmMADS1的cDNA克隆至中間載體pMD18-T，進一步克隆到雙元表達載體pBI121；

3)轉基因植株的獲得

將步驟2)獲得的表達載體轉入農桿菌菌株LBA4404，進一步轉入煙草，對獲得的轉基因植株進行PCR，RT-PCR驗證后進行植物的表型分析，獲得的GmMADS1轉基因植株提前開花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的數目增加，產生了萼片、雄蕊向花瓣的轉變，出現子房狀萼片、開裂的花瓣和彎曲的雄蕊，而且由于雄蕊彎曲和縮短，導致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADS1轉基因植株的花藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導致轉基因植株育性下降。