[發明專利]納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢測方法

有效

• 申請號: 201010156014.4
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101812529A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 景奉香;李海燕;賈春平;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/32
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

技術領域

本發明涉及一種納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢測方法，可 以應用于生物學及醫學領域。

背景技術

基因芯片技術是上世紀90年代初發展起來的一種全新的生物微量分析 技術。目前通用的基因芯片技術，且多采用熒光素為信號報告分子，難以臨 床推廣。2001年的發明專利“一種基因芯片的膜轉印檢測法及其應用”(ZL 01113298.1)雖提供了一種簡單快速、低成本的基因芯片檢測技術，該技術采 用裸眼或者普通的光學掃描儀分析記錄實驗結果，擺脫了基因芯片技術對昂 貴的熒光檢測設備的依賴，為基因芯片的推廣應用起到了巨大的推動作用。 但是，檢測靈敏度不夠高，生物樣品DNA需經PCR擴增以后方能檢測， 由此帶來的樣品污染等問題一直未能解決。

近年隨著納米科學技術的不斷發展，納米材料和納米結構取得了引人矚 目的成就，各種不同的納米功能材料不斷涌現，比如各種納米顆粒(納米磁 珠、納米金粒子)、納米管、納米棒、納米絲和納米薄膜等。納米材料具有傳 統材料所不具備的三大效應：表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應。 使得納米粒子在生物、醫學方面的應用越來越廣泛。各種納米信號分子，包 括量子點、各種熒光微球、納米金或者基于各種納米粒子的納米探針等，由 于其信號強度可以達到傳統熒光信號或者幾倍甚至幾十倍，成為較熒光分子 更為理想的生物標記材料。從而，本發明試圖將納米技術引入膜轉印檢測法 中，用納米顆粒同時標記檢測探針，不需要擴增即可通過普通光學掃描儀或 肉眼直接判讀信號有無成為可能。

發明內容

本發明的目的在于建立一種納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢 測方法，通過納米復合探針的信號放大作用，進一步提高基因芯片膜轉印檢 測法的靈敏度。

本發明的主要內容包括結構獨特的納米復合探針的構建以及其在基因芯 片膜轉印檢測技術中的應用。所敘述的納米復合探針為通過一定比例的，三 種探針標記的直徑5～50nm的納米粒子。具體關鍵技術如下：

1、納米復合探針的構建

用納米顆粒同時標記檢測探針P2和兩種長短不同的信號探針，檢測探針 與靶DNA一端互補，兩種帶有生物素的信號探針起信號放大作用。檢測探針 及信號探針的一端根據納米顆粒表面的活性基團進行不同的修飾。采用納米 金顆粒，則表面進行巰基(-SH)修飾，如果為羧基修飾的納米顆粒表面則進 行氨基修飾等等。信號探針的另一端進行生物素修飾。

為了降低空間位阻以實現最大的雜交效率及親和素-生物素反應效率，三 條探針的長度應該為DP2≥SP1＞SP2，且SP1堿基長度比SP2長10mer以上。

DP2、SP1、SP2以一定的比例混合，檢測探針與信號探針的比例[DP2∶ (SP1+SP2)]可根據納米粒子才尺寸來調整，對于常用的10-30nm納米粒子， 其比例在1∶5～1∶30之間效果最佳。SP1與SP2的比例亦在1∶5～1∶30 之間，1∶10效果最佳。(圖1a)

三種長度的探針以一定的比例混合，共同標記納米顆粒，所形成的空間 立體結構可以大大降低雜交及生物素-鏈親和素反應的空間位阻，提高檢測的 靈敏度。

2、雜交及顯色

雜交時，將制備好的納米復合探針與靶DNA混合，與芯片雜交(也可分 步雜交，靶DNA先與芯片雜交，然后再加入納米復合探針，中間無需洗滌)， 然后加入鏈親和素-堿性磷酸酶反應，最后膜轉印法顯色。，

鏈親和素-堿性磷酸酶也可以事前標記到包括納米金在內的納米顆粒上， 這樣做要求DP2探針長度要長。

膜轉印檢測法的信號檢測原理是基于堿性磷酸酶的顯色反應。本發明擬 通過信號探針的標記將生物素分子結合到包括納米金在內的納米顆粒表面， 但是由于SA-AP(Streptavidin-AP-conjugate)的尺寸效應大大限制了同一平面 上生物素分子的利用率。本發明是采用長短不同的兩種信號探針同時對包括 納米金在內的納米顆粒進行標記，從空間三維立體上降低了SA-AP與生物素反 應過程中由SA-AP的尺寸效應所帶來的空間位阻的影響，因此可以有效的增加 檢測信號強度。