[發明專利]納米復合探針及其用于基因芯片膜轉印的檢測方法

有效

• 申請號: 201010156014.4
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101812529A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 景奉香;李海燕;賈春平;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海微系統與信息技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/32
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

1.一種用于基因芯片膜轉印檢測法的復合探針，其特征在于所述的納米復合探針為三種探針共同標記的納米顆粒，其中所述的三種探針分別為檢測探針DP2和兩種長短不同的信號探針SP1和SP2，三種探針的長度DP2≥SP1＞SP2，且SP1堿基長度比SP2長10mer以上；DP2、SP1和SP2混合的比例為DP2/(SP1+SP2)＝1∶5-1∶30，其中SP1與SP2的比例在1∶5-1∶30之間。?

2.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于所述的三條探針共同標記納米顆粒所形成的空間立體結構降低雜交及生物素——鍵親和素反應的空間位阻，從而提高檢測靈敏度。?

3.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于SP1和SP2的比例為1∶10。?

4.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于檢測探針DP2與靶DNA一端互補，兩種帶有生物素標記的信號探針起信號放大作用。?

5.按權利要求1所述的納米復合探針，其特征在于檢測探針的一端根據納米顆粒表面的活性基團進行不同的修飾；所述的納米顆粒為5-50nm。?

6.按權利要求5所述的納米復合探針，其特征在于納米金顆粒進行疏基修飾；羧基修飾的納米顆粒表面進行氨基修飾。?

7.按權利要求1所述的納米復合探針的應用，其特征在于所述的納米復合探針用于檢測合成靶DNA分子，當納米金復合探針上的檢測探針和總信號探針數量比為1∶10，兩種信號探針T10和T40的數量比為9∶1時的檢測步驟是：A.芯片制備?

芯片點樣儀將氨基修飾探針點陣于醛基化修飾芯片表面，點直徑100μm，點間距500μm，點樣量為0.7nL，DNA探針濃度為75μmol/L，用點樣儀分別取三種探針溶液點于芯片相應位置。點陣好的芯片置于相對濕度為75％、溫度為30℃的密閉空間固定24～48小時；?

其中，① 合成目標DNA的序列為5’-ggccgtatctcagtccagacatgcatcccgtg-3’；?

② 檢測探針?P2的序列為5’-ggactgagatacggcc-poly(t)28-SH-3’；?

③ 信號探針1T10的序列為5’-NH₂-poly(t)₄₀-Biotin-3’；?

④ 信號探針2T40的序列為5’-SH-poly(t)₁₀-Biotin-3’；?

⑤ 捕獲探針P1的序列為5’-NH₂-poly(t)₁₀-cacgggatgcatgtct-3’、 陰性對照探針P3，序列號為5’-NH₂-poly(t)₁₀-cacgggaagcatgtct-3’和 定位點探針P4，序列號為5’-NH₂-poly(t)₁₀-ggccgtatctcagtcc-3’；?

B.納米金復合探針制備?

1.納米金顆粒的制備?

配制1nmol/L的HAuCl4、38.8mmol/L檸檬酸三鈉溶液。按預先設計的反應條件量取250ml?HAuCl4加熱回流10min并攪拌，快速加入檸檬酸三鈉溶液25ml，溶液顏色由淺黃迅速變為深紅時，再持續加熱回流15min并攪拌，待溶液持續攪拌自然冷卻至室溫，用0.22μm硝酸纖維薄膜過濾器過濾，即可得到尺寸為13nm的納米金溶液，4℃避光保存備用；?

2.納米金復合探針標記?

納米金顆粒表面標記有三種巰基修飾的DNA探針：兩種是帶有生物素的信號探針T10和T40，起信號放大作用；第三種是能與靶DNA分子另一端互補的檢測探針P2。?

納米金復合探針的標記方法：取濃度為12.5nmol/L的13nm納米金溶液1ml于EP管中，離心洗滌，沉淀用100μl0.1mol/L?PH值為7.2的PB液重懸；向重懸液中加入100μmol/L的DNA探針4μl，充分混勻，用5M?NaCl調NaCl濃度至0.1M，超聲處理10s后；放置25℃雜交儀中孵育過夜，然后加入1/10體積5％分子量為2000PEG，4℃過夜。用膠體金重懸液洗滌4次，棄上清，加100μl膠體金重懸液重懸，4℃儲存備用。用紫外-可見光光譜儀測其吸光光譜及OD值；用透射電鏡掃描DNA探針標記前后的納米金；?

C.芯片雜交及轉膜顯色?

檢測過程：1μl合成靶DNA與9μl雜交液混勻，均勻滴于芯片點陣區，蓋上蓋玻片，置35℃預熱的雜交盒中雜交30min，洗液I用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌芯片2min，氮氣吹干。2μl納米金復合探針溶液與8μl雜交液混勻，均勻滴于晾干芯片的點陣區，35℃雜交，30min，洗液I洗滌芯片5min，氮氣吹干；向點陣區加Streptavidin-AP-conjugate用封阻液稀釋500倍稀釋液15μl，室溫反應30min，洗液II再用0.05MTris-HCl，0.15M?NaCl，0.3％tween-20，PH7.5洗滌芯片5min，然后用0.1M?NaCl，0.05M?MgCl2，0.1MTris-HCl，PH值為9.5的平衡液平衡1min，氮氣吹干；用尼龍膜蘸取BCIP/NBT顯色液后覆蓋于芯片?點樣區，室溫避光放置30min，純化水洗滌尼龍膜，根據信號有無肉眼判讀結果

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