[發(fā)明專利]納米復(fù)合探針及其用于基因芯片膜轉(zhuǎn)印的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010156014.4
• 申請日: 2010-04-23
• 公開（公告）號: CN101812529A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 景奉香;李海燕;賈春平;金慶輝;趙建龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/32
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 潘振甦

1.一種用于基因芯片膜轉(zhuǎn)印檢測法的復(fù)合探針，其特征在于所述的納米復(fù)合探針為三種探針共同標(biāo)記的納米顆粒，其中所述的三種探針分別為檢測探針DP2和兩種長短不同的信號探針SP1和SP2，三種探針的長度DP2≥SP1＞SP2，且SP1堿基長度比SP2長10mer以上；DP2、SP1和SP2混合的比例為DP2/(SP1+SP2)＝1∶5-1∶30，其中SP1與SP2的比例在1∶5-1∶30之間。?

2.按權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合探針，其特征在于所述的三條探針共同標(biāo)記納米顆粒所形成的空間立體結(jié)構(gòu)降低雜交及生物素——鍵親和素反應(yīng)的空間位阻，從而提高檢測靈敏度。?

3.按權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合探針，其特征在于SP1和SP2的比例為1∶10。?

4.按權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合探針，其特征在于檢測探針DP2與靶DNA一端互補，兩種帶有生物素標(biāo)記的信號探針起信號放大作用。?

5.按權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合探針，其特征在于檢測探針的一端根據(jù)納米顆粒表面的活性基團(tuán)進(jìn)行不同的修飾；所述的納米顆粒為5-50nm。?

6.按權(quán)利要求5所述的納米復(fù)合探針，其特征在于納米金顆粒進(jìn)行疏基修飾；羧基修飾的納米顆粒表面進(jìn)行氨基修飾。?

7.按權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合探針的應(yīng)用，其特征在于所述的納米復(fù)合探針用于檢測合成靶DNA分子，當(dāng)納米金復(fù)合探針上的檢測探針和總信號探針數(shù)量比為1∶10，兩種信號探針T10和T40的數(shù)量比為9∶1時的檢測步驟是：A.芯片制備?

芯片點樣儀將氨基修飾探針點陣于醛基化修飾芯片表面，點直徑100μm，點間距500μm，點樣量為0.7nL，DNA探針濃度為75μmol/L，用點樣儀分別取三種探針溶液點于芯片相應(yīng)位置。點陣好的芯片置于相對濕度為75％、溫度為30℃的密閉空間固定24～48小時；?

其中，① 合成目標(biāo)DNA的序列為5’-ggccgtatctcagtccagacatgcatcccgtg-3’；?

② 檢測探針?P2的序列為5’-ggactgagatacggcc-poly(t)28-SH-3’；?

③ 信號探針1T10的序列為5’-NH₂-poly(t)₄₀-Biotin-3’；?

④ 信號探針2T40的序列為5’-SH-poly(t)₁₀-Biotin-3’；?

⑤ 捕獲探針P1的序列為5’-NH₂-poly(t)₁₀-cacgggatgcatgtct-3’、 陰性對照探針P3，序列號為5’-NH₂-poly(t)₁₀-cacgggaagcatgtct-3’和 定位點探針P4，序列號為5’-NH₂-poly(t)₁₀-ggccgtatctcagtcc-3’；?

B.納米金復(fù)合探針制備?

1.納米金顆粒的制備?

配制1nmol/L的HAuCl4、38.8mmol/L檸檬酸三鈉溶液。按預(yù)先設(shè)計的反應(yīng)條件量取250ml?HAuCl4加熱回流10min并攪拌，快速加入檸檬酸三鈉溶液25ml，溶液顏色由淺黃迅速變?yōu)樯罴t時，再持續(xù)加熱回流15min并攪拌，待溶液持續(xù)攪拌自然冷卻至室溫，用0.22μm硝酸纖維薄膜過濾器過濾，即可得到尺寸為13nm的納米金溶液，4℃避光保存?zhèn)溆茫?

2.納米金復(fù)合探針標(biāo)記?

納米金顆粒表面標(biāo)記有三種巰基修飾的DNA探針：兩種是帶有生物素的信號探針T10和T40，起信號放大作用；第三種是能與靶DNA分子另一端互補的檢測探針P2。?

納米金復(fù)合探針的標(biāo)記方法：取濃度為12.5nmol/L的13nm納米金溶液1ml于EP管中，離心洗滌，沉淀用100μl0.1mol/L?PH值為7.2的PB液重懸；向重懸液中加入100μmol/L的DNA探針4μl，充分混勻，用5M?NaCl調(diào)NaCl濃度至0.1M，超聲處理10s后；放置25℃雜交儀中孵育過夜，然后加入1/10體積5％分子量為2000PEG，4℃過夜。用膠體金重懸液洗滌4次，棄上清，加100μl膠體金重懸液重懸，4℃儲存?zhèn)溆谩Ｓ米贤?可見光光譜儀測其吸光光譜及OD值；用透射電鏡掃描DNA探針標(biāo)記前后的納米金；?

C.芯片雜交及轉(zhuǎn)膜顯色?

檢測過程：1μl合成靶DNA與9μl雜交液混勻，均勻滴于芯片點陣區(qū)，蓋上蓋玻片，置35℃預(yù)熱的雜交盒中雜交30min，洗液I用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌芯片2min，氮氣吹干。2μl納米金復(fù)合探針溶液與8μl雜交液混勻，均勻滴于晾干芯片的點陣區(qū)，35℃雜交，30min，洗液I洗滌芯片5min，氮氣吹干；向點陣區(qū)加Streptavidin-AP-conjugate用封阻液稀釋500倍稀釋液15μl，室溫反應(yīng)30min，洗液II再用0.05MTris-HCl，0.15M?NaCl，0.3％tween-20，PH7.5洗滌芯片5min，然后用0.1M?NaCl，0.05M?MgCl2，0.1MTris-HCl，PH值為9.5的平衡液平衡1min，氮氣吹干；用尼龍膜蘸取BCIP/NBT顯色液后覆蓋于芯片?點樣區(qū)，室溫避光放置30min，純化水洗滌尼龍膜，根據(jù)信號有無肉眼判讀結(jié)果

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