[發明專利]一種乳腺上皮細胞的組織塊種植方法

無效

• 申請號: 201010155429.X
• 申請日: 2010-04-26
• 公開（公告）號: CN101812428A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 王楨;羅軍;王偉;趙旺生;林先滋;滕炎玲
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 黃挺

技術領域

本發明涉及一種乳腺上皮細胞的組織塊種植方法。

背景技術

乳腺是哺乳動物少數可以重復經歷生長，功能分化和退化過程的器官之一。由于外源基因可以在乳腺中表達后隨乳汁流出，乳腺上皮細胞成為轉基因研究中重要的靶細胞。乳腺上皮細胞的體外培養對于研究乳腺生長發育及闡明泌乳分子調控機制有重要意義，同時也為轉基因研究提供有效模型。

進行乳腺上皮細胞體外培養首先要獲得一定數量的原代乳腺上皮細胞。目前應用最多的是組織塊種植法。組織塊種植法需要將組織塊種植到培養皿中，待貼壁后4-8天會陸續有細胞遷出。如果直接種植，加入培養液后大部分組織塊會漂起，不利于細胞遷出。傳統方法是預先在皿底鋪一層膠原，使組織塊黏附在皿底，并促進組織塊貼壁。

現在國內一般采用自制鼠尾膠原，制備過程十分繁瑣，需經過浸乙醇、浸酸、4度過夜及高壓滅菌諸多步驟。對于長期從事泌乳機理及轉基因研究的實驗室，如果能找到一種簡單高效又易得的物質來代替膠原將是十分有利的。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種乳腺上皮細胞的組織塊種植方法。

本發明提供一種乳腺上皮細胞的組織塊種植方法，包括如下步驟：

1)預處理：以血清鋪滿培養皿，靜置。上述血清優選胎牛血清(FBS)，靜置條件為：室溫，30min。

2)種植：在所述培養皿中種植乳腺組織塊，優選西農薩能羊乳腺腺泡組織塊，收集乳腺上皮細胞和成纖維細胞。種植的具體步驟為：

a.清洗乳腺組織，將其切割成塊；

b.在所述培養皿中接種組織塊，并置于培養箱中，20～30分鐘；

c.向培養皿中加入培養液，1～2小時后再補加培養液，在37℃、5％CO₂、飽和濕度培養箱中靜置培養兩天，第三天更換培養液，以后每兩到三天更換一次培養液，即得乳腺上皮細胞和成纖維細胞。上述培養液為含如下濃度成分的D-MEM/F-12培養基：體積百分比10％的FBS、5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、5mg/L表皮生長因子和10萬IU/L的青鏈霉素雙抗。

3)純化：除去成纖維細胞，得到乳腺上皮細胞。純化的具體步驟為：

a.在上皮細胞與成纖維細胞混合物中，加入消化液，37℃消化，待成纖維細胞脫離瓶壁時，終止消化，將消化液吸出，再加入適量消化液，37℃繼續消化5～6min，加入所述培養液后吸管吹打懸浮細胞，離心后收集細胞；

b.在步驟a收集的細胞中加入所述培養液，轉移至培養皿中，成纖維細胞貼壁后，將所述培養液吸出，將培養皿中細胞更換至一個新的培養皿中，再加入所述培養液，如此經過3～4次，即可得到乳腺上皮細胞。

作為優選，上述消化液為含以下濃度成分的水溶液：胰蛋白酶0.5g/L，NaCl?8g/L，KCl?0.4g/L，葡萄糖1g/L，NaHCO30.58g/L，EDTA?0.2g/L，酚紅0.002g/L和青鏈霉素雙抗10萬IU/L。

本發明的有益效果是：提供了一種乳腺組織塊種植的最佳方案，省去傳統方法中制備膠原的繁瑣步驟，利用血清種植，獲得較高組織塊貼壁率，最終得到形態良好、數量較多的乳腺上皮細胞。

附圖說明

圖1是消化中的原代細胞。

圖2是純化后的乳腺上皮細胞。

圖3是乳腺上皮細胞角蛋白免疫熒光鑒定。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。

(1)乳腺上皮細胞的原代培養

手術法西北農林科技大學薩能羊原種場健康的純種西農薩能羊乳腺腺泡組織。用3倍雙抗的D-Hank’s液反復沖洗乳腺組織，直到組織發白、沖洗液清亮為止。在超凈臺分離修剪，剝離脂肪組織和結締組織，將呈白色顆粒狀的腺泡組織剪成約1mm3大小。用胎牛血清(FBS)預處理培養皿，然后按照0.5cm左右間隔在皿中接種組織塊，置37℃、5％CO₂、飽和濕度的培養箱中20～30分鐘左右，使組織塊微干涸，然后向培養皿中輕輕加入約1mL培養液，置CO₂培養箱中培養1～2小時后再補1mL培養液，在培養箱內靜置培養兩天，第三天更換培養液，以后每兩到三天更換一次培養液。3-4天可以看到組織塊周圍有成纖維細胞遷出，第8天左右可以看到混合生長的乳腺上皮細胞和成纖維細胞。