[發明專利]一種重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化工藝

有效

• 申請號: 201010154987.4
• 申請日: 2010-04-26
• 公開（公告）號: CN102234332A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發明（設計）人: 聶磊;王歡;郭婷婷;蔡秀云;白驊
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18
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技術領域

本發明屬于蛋白質分離純化技術領域，特別是對重組的人血白蛋白的純化。?

背景技術

人血白蛋白(HSA)，是血漿中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40％-60％，它是血漿中很重要的載體，在體液pH7.4的環境中，白蛋白為負離子，每分子可以帶有200個以上負電荷。許多水溶性差的物質可以通過與白蛋白的結合而被運輸。這些物質包括膽紅素、長鏈脂肪酸(每分子可以結合4-6個分子)、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子(如Cu²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺)藥物(如阿司匹林、青霉素等)。另一個作用為維持滲透壓。?

白蛋白的分子結構已于1975年闡明，為含585個氨基酸殘基的球狀蛋白質，分子量為66458Da，分子中含17個二硫鍵，不含有糖的組分。人血白蛋白基因位于4號染色體上有16961對堿基對，分為15個間隔區。經過RNA加工拼接后表達的m?RNA可以編碼一個具有585個氨基酸的蛋白質。?

人血白蛋白有很大的應用及臨床應用價值。例如：作為藥物可用于治療因血清白蛋白合成障礙和創傷失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血癥；可以作為細胞培養基的添加成份，可以作為藥物的輔劑，賦型劑；具有活性的激素或藥物當與白蛋白結合時，可以不表現其活性，而視為其儲存形式，由于這種結合的可逆性和處于動態平衡，因此在調節這些激素和藥物的代謝上，具有重要意義。?

現在人類是從人血液中分離純化人血白蛋白的。然而這一方法存在巨大的問題，例如：血源的短缺、受到乙肝病毒、AIDS病毒等病原微生物的污染，因此基于重組DNA的技術方法生產重組人血白蛋白(rHA)的多種方法獲得研發。利用微生物體重組表達人血白蛋白的大規模生產和純化方法可行。這種方法最近已經得到了開發。為數不少的重組方法可以使用，但從發酵液中提純rHA仍是至關緊要的且隨時有待提高的步驟。?

從人血液中分離純化人血白蛋白，抗原性物質少，對提純的技術要求相對?較低。與之相比，利用基因工程重組技術表達的白蛋白，外源性物質較多，而且由于人血白蛋白注射劑量較大，微量的抗原性物質都可能引起過敏反應，甚至危害患者的生命安全，因此對基因工程重組人血白蛋白的純度要求更高，純化技術難度更大。?

EP0612761公開了一種生產高純度重組人血白蛋白的方法，其產品中不含自由的非抗原性雜質。這一方法在特定環境下運用了疏水層析色譜(HIC)，還有其它步驟如：離子交換色譜，硼酸或硼酸鹽處理，超濾及加熱處理。然而，這一方法因步驟多而太復雜，從而難于滿足大規模工業生產的要求。?

EP0570916公開了用基因操作技術生產rHA的方法，該方法包括：超濾發酵上清液、加熱處理、酸處理和再次超濾，隨后使用陽離子交換、疏水層析和陰離子交換以及鹽析等一系列純化步驟。然而，因與EP0612761存在相似的問題，純化過程太復雜、周期長、成本高而不能成為大規模生產的有效方法。?

EP0699687公開的rHA純化方法為：加熱細胞培養液以滅活蛋白酶，再經陽離子交換微粒的流化床處理，洗脫液再經超濾、HIC和陰離子交換層析而得到純rHA。然而，流化床對設備的要求與常規裝填的層析設備不同，因而，仍需更經濟有效的方法從發酵液中純化rHA。?

所以，開發一種穩定的、高效的、用于重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化方法非常重要。?

發明內容

本發明的目的之一是提供一種區別于目前常用的從人血漿中提純人血白蛋白的方法，本發明是一種適合大規模操作的從發酵液或哺乳動物培養液中分離提純重組人血白蛋白的方法。?

本發明可以通過以下層析步驟達到：?

(1)將含重組人血白蛋白的發酵上清液進行固定化金屬螯合親和層析，?

(2)將步驟(1)的產物經過疏水層析，?

(3)將步驟(2)的產物經過陰離子交換層析(疏水型陰離子交換層析)。?