[發明專利]用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法

無效

• 申請號: 201010154433.4
• 申請日: 2010-04-20
• 公開（公告）號: CN101813681A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 董元火;萬昆;張金安
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: G01N30/74
• 分類號: G01N30/74;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 俞鴻

技術領域

本發明涉及一種DNA甲基化含量的測定方法，具體是指一種用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法。

背景技術

DNA甲基化已成為分子生物學研究熱點之一。有研究表明，逆境(如冷、熱脅迫、光照、干旱、鹽脅迫、重金屬脅迫)對DNA的甲基化水平會造成影響。DNA甲基化水平在不同組織和不同生長時期以及不同環境下可能有差異。并且，基因表達活性同DNA胞嘧啶甲基化程度之間存在負相關性，DNA甲基化程度越低，基因表達活性越高；反之，DNA甲基化程度越高，基因表達活性也就越低。同時，DNA甲基化對植物生長和發育都有重要影響。如果甲基化不足或太高，都會導致植物生長發育的不正常和形態異常。因此，研究植物DNA甲基化對探討植物生長發育的機制和指導實際生產有重要的意義。

水蕨是一種名貴的菜肴。因其為二型葉，造型美觀，也常用作園藝觀賞植物。同時它還是重要的藥用植物，有活血、解毒、治痞積、痢疾、胎毒和跌打等功效。因此在基礎研究和應用中起了很重要的作用。開展對瀕危水生蕨類植物水蕨DNA甲基化水平的研究，有利于指導水蕨人工栽培條件的優化，促進其正常生長和發育，有利于水蕨的食用、藥用和觀賞資源的合理利用與開發，有利于促進“菜藍子工程”和人民身體健康工作的開展，有利于“兩型社會”的構建。

目前，測定DNA甲基化含量的方法有微陣列方法(DNAMicroarray)、基因芯片、和甲基化敏感擴增多態性(Mthylation-Sensitive?Amplified?Polymorphism，MSAP)方法，甲基化敏感性斑點分析(MS-DBA)等多種測定方法，但由于技術復雜，成本高，在實際生產中很難推廣應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種方法簡單，并且節省成本，又能準確測定水蕨DNA甲基化含量的測定方法。

本發明是通過如下技術方案實現的：

用高效液相色譜測定水蕨DNA甲基化含量的方法，其步驟包括：

1)采集待測的水蕨樣品并提取樣品中的DNA，得到待測DNA樣品，溶解于緩沖液后于-20℃保存備用；

2)將待測DNA樣品水解并離心，取上層清液，得到待測樣品溶液；

3)配制胞嘧啶標準樣品溶液和5-甲基胞嘧啶標準樣品溶液，在相同的高效液相色譜測定條件下，通過標準樣品溶液和待測樣品溶液的峰的保留時間和峰面積來確定待測DNA樣品中的DNA甲基化含量。所述高效液相色譜的流動相為質量分數為5％的甲醇溶液，質量分數為0.2％的三乙醇溶液和質量分數為94.8％且摩爾濃度為5mmol/L的戊烷磺酸鈉混合組成，并且用磷酸調節混合溶液pH值到4的混合溶液。

所述流動相的流速為1mL/min。

所述高效液相色譜的檢測器為紫外檢測器，檢測紫外光波長為273nm。

所述將待測DNA樣品水解并離心的方法為，向待測DNA樣品加入0.2mmol/L的鹽酸溶液，在80℃水浴上加熱水解2h，再加入0.4mmol/L的氫氧化鈉水溶液進行中和，最后在10000r/min的轉速下離心10min后即完成待測DNA樣品水解并離心的過程。

本發明利用高效液相色譜(HPLC)來進行水蕨的DNA甲基化含量的測定，不僅方法簡便，成本較低，并且測定快速準確，定量分析效果較好。通過對水蕨DNA甲基化含量的測定，可以為分析水蕨的生長發育狀況提供了技術上的支撐，有利于指導實際生產與應用。同時，由于HPLC技術本身已經應用非常廣泛，技術相對成熟，并且水蕨中提取DNA也為常規方法可以達到，因此可以推廣應用。

附圖說明

圖1為混合標準溶液的HPLC色譜圖；

圖2為待測樣品溶液的HPLC色譜圖。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明：

實施例1

取江蘇吳江太湖水蕨，每株幼嫩葉約50mg，置于密封的塑料袋中用硅膠快速干燥后，用CTAB法提取水蕨DNA，再用紫外分光光度法檢測DNA的純度和濃度。最后將沉淀DNA溶于50μl緩沖液TE中，于-20℃下保存備用。取上述待測DNA樣品20μl，加入0.2mmol/L的HCl溶液20μl，在80℃水浴上水解2h，再加入0.4mmol/L的NaOH溶液10μl來中和水解液，在10000r/min的轉速下離心10min，取上層清液，得到待測樣品溶液。

稱取購于Sigma公司的胞嘧啶(C)標準樣品和購于北京鼎國生物技術有限責任公司的5-甲基胞嘧啶(5MeC)標準樣品各15mg，然后各自用甲醇定容5ml，得到標準溶液。