[發(fā)明專利]一種鑒別免疫動物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010151344.4
• 申請日: 2010-04-21
• 公開（公告）號: CN101833002A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵衛(wèi)星;李一經(jīng);孫慶杰;魏榮;葛俊偉
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué);中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N15/44;C12N15/866;C12N7/01;C07K14/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鑒別接種了A型流感“標(biāo)記”疫苗動物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗方法，具體涉及一種檢測A型流感病毒NA蛋白血清抗體的間接免疫熒光試驗方法，是A型流感“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法。

背景技術(shù)

A型流感，如H5N1亞型禽流感、H1N1甲型流感是一種嚴(yán)重的人畜共患病，既可給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，又可以導(dǎo)致人的死亡，在世界許多國家流行，其中包括我國。經(jīng)典的預(yù)防A型流感(如禽流感H5N1亞型)的措施包括采取嚴(yán)格的生物安全措施、限制有感染流感病毒風(fēng)險動物的移動，撲殺感染病毒的動物。疫苗接種是防控流感的一種非常有效地手段，盡管免疫接種能提高動物的抵抗力，使免疫動物不表現(xiàn)出臨床癥狀和感染動物減少排毒數(shù)量，但并不能完全阻止病毒的感染，也就是說接種了疫苗的動物接觸到病毒后，可能成為健康的帶毒者。所以，作為免疫接種的配套手段，需要嚴(yán)密的監(jiān)測接種了疫苗的動物，檢測動物群是否存在健康帶毒禽，以便采取相應(yīng)的措施，以防病毒隨著帶毒動物的移動而向外傳播，更不利于該病的控制。

鑒別免疫動物，如禽、豬等是否攜帶A型流感病毒歷來是動物疫病防控措施難點，尤其是通過檢測抗體進(jìn)行鑒別診斷。一個有效方法是給動物，如禽、豬等免疫接種“標(biāo)記”疫苗，然后針對疫苗的“標(biāo)記”，檢測相應(yīng)蛋白抗體，可鑒別診斷出免疫動物是否感染A型流感病毒。例如給雞接種表達(dá)H5N1病毒HA基因的重組雞痘病毒疫苗或用與流行病毒(H5N1)不同NA亞型的病毒(H5N3)制備滅活疫苗等，通過檢測血清中N1蛋白抗體(這種抗體只有病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生，而“標(biāo)記”疫苗不能產(chǎn)生)判定免疫了“標(biāo)記”疫苗的雞是否感染H5N1亞型流感病毒，一旦檢測到N1抗體就表明該禽感染了禽流感病毒(H5N1亞型)。

現(xiàn)有技術(shù)中一般采用“哨兵”動物，來判定免疫動物群是否感染A型流感病毒。所謂的“哨兵”動物是指沒有免疫的動物，即不含有相應(yīng)A型流感病毒的抗體。把“哨兵”動物隨機(jī)放到免疫動物群中，經(jīng)過與免疫動物接觸一段時間，檢測“哨兵”動物血清中相應(yīng)亞型流感病毒的抗體，如果為陽性，則判定該動物群有相應(yīng)亞型流感病毒流行。用“哨兵”動物來判定免疫動物群是否感染A型流感病毒存在以下缺點：

1.成本高。“哨兵”動物必須是無特定病原動物，即不能含有某種病原，如A型流感病毒，才能作為“哨兵”動物，在使用“哨兵”動物前，必須飼養(yǎng)在特殊的環(huán)境中，因此，“哨兵”動物的成本很高，而且在使用時需要投放一定數(shù)量。

2.難以大范圍使用。為了鑒別動物群是否感染野毒，必須對每群動物投放一定比例的“哨兵”動物，這在實際操作中不具有可行性，只能針對風(fēng)險性最高的動物群實施，因此，難以大范圍應(yīng)用。

3.只能在群體水平進(jìn)行鑒別。使用“哨兵”動物只能在群體水平鑒別動物群是否感染野毒，不能了解和掌握動物群感染的比例和狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種鑒別免疫動物，如禽、豬等是否感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗。通過檢測A型流感病毒NA蛋白血清抗體進(jìn)行判斷，該方法操作簡單，結(jié)果判定直觀，特異性好。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種檢測A型流感病毒NA蛋白血清抗體的間接免疫熒光試驗方法，包括如下步驟：

(1)采集接種了A型流感“標(biāo)記”疫苗的動物，如禽、豬等血液，分離血清，并用PBS溶液稀釋；

(2)表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，并表達(dá)NA蛋白；

(3)將步驟(1)中稀釋的禽血清加入到步驟(2)中表達(dá)NA蛋白的昆蟲細(xì)胞上，室溫作用一段時間；

(4)用PBS溶液漂洗，然后加入適量FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗，室溫作用一段時間；

(5)用PBS溶液漂洗，然后加入適量碳酸甘油緩沖液，在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光出現(xiàn)；

(6)根據(jù)觀察的結(jié)果判斷動物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒。

進(jìn)一步，如上所述的鑒別免疫動物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗方法，在步驟(2)中獲得接種了表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒，具體方法如下：

①使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增A型流感病毒NA基因；

②把NA基因克隆到昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體(pFast-Bac)中，獲得表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒；

③把重組桿狀病毒接種到昆蟲細(xì)胞上表達(dá)NA蛋白，一段時間后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用丙酮固定細(xì)胞，直接作為抗原檢測NA血清抗體。