[發(fā)明專利]一種檢測基因融合的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010150494.3
• 申請日: 2010-04-20
• 公開（公告）號: CN102234681A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳一龍;張緒超;朱冠山;張仕蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省人民醫(yī)院;阿斯利康投資(中國)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，更具體地涉及一種檢測基因融合的方法、試劑以及試劑盒。

背景技術(shù)

研究表明，在哺乳動物(如人)中，基因融合是導致某些疾病(如癌癥)的原因之一。

以間變性淋巴瘤激酶基因(Anaplastic?lymphoma?kinase，簡稱為“ALK”)為例，該基因編碼一蛋白激酶受體^[1]。活化的ALK基因通過PIK3CA/AKT以及MAPK通路對細胞的抗凋亡和增殖發(fā)揮作用^[2]。ALK基因的異位多發(fā)在間變性淋巴瘤，神經(jīng)性母細胞瘤以及肌纖維瘤中^[3]。

ALK異位產(chǎn)生的融合蛋白發(fā)揮著致癌基因的作用，這種融合蛋白保留了ALK的胞內(nèi)激酶部分并融合了與其融合的蛋白的N端部分。目前已報道的與ALK發(fā)生融合的基因有11種之多，如NPM^[4]，EML4^[1]，MSN^[5]，TPM3^[6，7]，ATIC，TFG，CARS，以及CLTC^[8，9，10]等。

在諸多的ALK融合基因中，對于非小細胞肺癌，一種棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4(EML4)/間變淋巴瘤激酶(ALK)的融合基因(EML4-ALK)于2007年開始見諸于NSCLC相關(guān)研究當中^{[1，11，12]}。

間變淋巴瘤激酶(ALK)/棘皮動物微管相關(guān)蛋白樣4(EML4)融合基因(EML4-ALK)在非小細胞肺癌中占有一定的比例，且研究表明其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。EML4-ALK融合由第二號染色體短臂異位引起，目前已發(fā)現(xiàn)有6種不同的融合類型。對這些融合基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其ALK部分均包括開始于第20外顯子的編碼細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的基因片段，而EML4部分則包括長短不一的編碼蛋白N端部分的基因片段。

將ALK融合基因轉(zhuǎn)入3T3細胞以及Ba/F3動物模型的研究表明，所有這些融合基因均能二聚化并組成型活化。ALK融合基因的表達產(chǎn)物作為一種嵌合酪氨酸激酶，對肺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用^[13，14]。因此，對ALK融合基因的檢測具有重要意義。

目前，對ALK融合基因的研究大部分的采用RT-PCR的方法，小部分研究采用免疫組化、FISH的方法進行檢測。

RT-PCR的方法是針對已知的ALK融合基因的類型以及融合方式來設(shè)計引物，將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA之后，通過PCR擴增目的片斷的方式來進行檢測。該方法的局限性：1)必須知曉與ALK基因發(fā)生融合的基因；2)必須知曉兩基因發(fā)生融合的方式；3)不能或難以同時檢測不同基因與ALK發(fā)生的融合。因此利用該方法須針對與ALK發(fā)生融合的不同基因，必須根據(jù)不同融合方式設(shè)計不同的引物來進行檢測，且不能檢測出未知的ALK融合基因以及未知的融合方式，這將直接導致ALK融合基因檢測困難及檢出率的降低。例如，目前已報道的EML4-ALK的基因融合在肺癌中的檢出頻率在0.5％-7.5％之間^[15]

非放射性原位雜交技術(shù)FISH法的原理是設(shè)計與被檢測的EML4-ALK同源互補的核酸探針，二者經(jīng)變性-退火-復性，即可形EML4-ALK融合基因的DNA與核酸探針的雜交體。用報告分子(如生物素、地高辛)標記核酸探針的某一種核苷酸，可利用該報告分子與熒光素標記的特異性配基(如特異性與生物素結(jié)合的親和素)之間的免疫化學反應，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性以及相對定位分析。然而，該方法局限性：1)必須知曉與ALK基因發(fā)生融合的基因；2)與ALK發(fā)生融合的基因所在染色體的位置必須與ALK相距較近的距離；3)不能同時檢測不同基因與ALK發(fā)生的融合。因此該方法須針對與ALK基因發(fā)生融合的不同基因設(shè)計不同的探針，且不能檢測出未知的ALK融合基因，這將影響到ALK基因的檢測率。

鑒于各種融合基因(如ALK融合基因)的表達產(chǎn)物對癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更為通用的融合基因檢測方法。

此外，本發(fā)明還迫切需要開發(fā)，在部分知曉或未知曉融合基因結(jié)構(gòu)的情況下，能夠準確靈敏地檢測方法來檢測融合基因(如ALK融合基因)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的就是提供一種通用性更高的檢測融合基因的方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠在僅部分知曉或未知曉融合基因結(jié)構(gòu)的情況下，準確靈敏地檢測方法來檢測融合基因(如ALK融合基因)的方法。