[發(fā)明專利]一種檢測基因融合的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010150494.3
• 申請(qǐng)日: 2010-04-20
• 公開（公告）號(hào): CN102234681A
• 公開（公告）日: 2011-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳一龍;張緒超;朱冠山;張仕蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省人民醫(yī)院;阿斯利康投資(中國)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅

1.一種非診斷性的、體外檢測樣本中的多核苷酸是否存在基因融合的方法，其中所述的融合基因是第一基因與第二基因融合形成的，其特征在于，包括步驟：

1)以檢測樣本的mRNA為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，利用基因特異性引物1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而擴(kuò)增得到cDNA鏈，其中所述的擴(kuò)增的cDNA鏈的序列跨越了第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的融合區(qū)；

其中，所述的基因特異性引物1位于第一基因以及與其發(fā)生融合的第二基因的遠(yuǎn)端，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；

2)在cDNA的3’端添加多聚C(polyC)的尾巴；

3)以添加了polyC尾的cDNA鏈為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用與多聚C錨定引物與基因特異性引物2進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，從而獲得第一PCR產(chǎn)物；

其中所述的多聚C錨定引物包括(a)位于引物3’端的、與多聚C尾互補(bǔ)的polyG結(jié)合區(qū)，以及(b)位于引物5’端的錨定區(qū)，其中所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；

所述的基因特異性引物2位于第一基因以及與其發(fā)生融合的基因的遠(yuǎn)端，且不超過基因特異性引物1，從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；

4)以第一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在特異性擴(kuò)增條件下，用錨定引物與基因特異性引物3進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，從而獲得第二PCR產(chǎn)物；

其中所述的錨定引物包括位于引物3’端的、與多聚C錨定引物的錨定區(qū)相同或互補(bǔ)的錨定區(qū)，所述的錨定區(qū)既不與多聚C尾互補(bǔ)，也不與polyG結(jié)合區(qū)互補(bǔ)；

其中，所述的錨定區(qū)不與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3相同或互補(bǔ)，即不會(huì)與特異性引物1、特異性引物2或特異性引物3發(fā)生特異性結(jié)合；

所述的基因特異性引物3位于基因特異性引物2和基因特異性引物1的內(nèi)側(cè)，即從基因特異性引物1的擴(kuò)增方向看，依次為基因特異性引物1、基因特異性引物2、基因特異性引物3、第一基因(或其部分)以及與第一基因發(fā)生融合的第二基因；

5)對(duì)得到的長度大于陰性對(duì)照的第二PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以得到與第一基因發(fā)生融合的基因序列，從而確定所述的多核苷酸是否存在基因融合。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1)和2)之間，還包括步驟：步驟1)獲得的cDNA鏈為模板，用內(nèi)部質(zhì)控引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內(nèi)部質(zhì)控引物是特異性擴(kuò)增出第一基因(或其部分片段)的引物對(duì)。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一基因選自下組：ALK基因。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二基因是選自下組的一種或多種基因：NPM，EML4，MSN，TPM3，ATIC，TFG，CARS，以及CLTC。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的polyC尾的長度為8-20bp；和/或

所述的polyG結(jié)合區(qū)的長度為8-20bp；和/或

所述的多聚C錨定引物的錨定區(qū)的長度為15-30bp；和/或

所述的錨定引物的錨定區(qū)的長度為15-30bp。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物1和/或基因特異性引物2和基因特異性引物3特異性結(jié)合于第一基因的外側(cè)、結(jié)合于第一基因的外側(cè)和第一基因本身、或者僅結(jié)合于第一基因本身。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法使用選自下組的一種或多種引物：

序列如SEQ?ID?NO：1所示的基因特異性引物1；

序列如SEQ?ID?NO：2所示的多聚C錨定引物；

序列如SEQ?ID?NO：3所示的基因特異性引物2；

序列如SEQ?ID?NO：4所示的錨定引物；

序列如SEQ?ID?NO：5所示的基因特異性引物3。