[發明專利]魚肉制品中金槍魚種源的檢測方法

無效

• 申請號: 201010150275.5
• 申請日: 2010-03-17
• 公開（公告）號: CN102191315A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 高宏偉;林超;孫敏;劉彩霞;徐彪
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測食品中金槍魚的快速檢測方法。

背景技術

海洋捕撈的海洋大型魚類一直是世界各國人民喜愛的食品，也是國際貿易的重要商品種類。海洋大型魚類在貿易中常常包括加工成魚肉片或者魚肉塊，更包括一些魚的內臟或者其他深加工的產品。這些產品從外觀上已經不能看出用來加工的原料魚種類，因此需要不受外觀和加工工藝的限制來確認商品的真偽。

基于DNA的檢測方法可以從基因水平進行物種鑒定。實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好、定量準確、全封閉反應等優點，得到研究者的普遍認可，成為基因檢測和鑒定的重要工具。目前國內外還沒有對金槍魚物種的鑒定方法公開，本發明可彌補上述缺陷，完成魚肉制品中金槍魚種源的鑒定。

發明內容

本發明屬于魚肉制品中物種來源鑒定的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測食品中金槍魚的快速檢測方法。克服基于形態學的檢測方法在魚類產品加工過程中帶來的鑒定困難，為確定金槍魚的種源提供技術手段，從而確保食品標簽的一致性。

本發明的主要原理為：針對保守序列設計一組引物：上游引物Jinqiang230F5’-CTCCCTCTTTCCTTCTGC-3’；Jinqiang568R：5’-AGGTTGTATTTAGGTTTCG-3’。利用裂解液破碎細胞，三氯甲烷抽提蛋白質，異丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA為模板進行PCR擴增；測定熔解曲線時，在反應體系中加入熒光染料Eva?Green，染料與DNA雙鏈結合并發出熒光，由于反應中存在少量的非特異聚合體(如引物二聚體等)，能引起干擾，但非特異聚合體的熔解溫度較特異性結合低，當擴增結束后，再緩慢加溫，當DNA變性后，染料被釋放，熒光減少，而非特異性結合先于特異性結合減少，對熔解過程進行連續動態監測可得熔解曲線，通過曲線將非特異性訊號和特異性訊號區分出來，同時對特異性訊號區，熒光減少的快慢與濃度的對數成正比，以此可以確定是否有引物特異性擴增產物。

本發明涉及的金槍魚種源快速檢測方法，其中的試劑包括如下：

(1)PCR擴增反應液

包括10×PCR反應緩沖液、0.1-0.4mmol/L?dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、1-2U?Taq酶、0.2-0.6μmol/L?上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、1.25μL20×Eva?Green染料(美國Biotum公司)；

其中10×PCR反應緩沖液含有100mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通X-100；

上游引物Jinqiang230F?5’-CTCCCTCTTTCCTTCTGC-3’；Jinqiang568R：5’-AGGTTGTATTTAGGTTTCG-3’。其中上游引物、下游引物體積比為：1∶1；

使用上述試劑盒檢測食品中金槍魚種源的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)：

(1)待檢樣品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。DNA提取質量使用OD₂₆₀和OD₂₈₀的光吸收來衡量，或者使用其他方法衡量。

(2)金槍魚種源的實時熒光PCR擴增

A.在裝有24μL?PCR擴增反應液A的反應管中加入1μL待檢樣品DNA，混勻。

B.檢測過程中分別設陽性對照、空白對照。使用具有溯源性的陽性標準物質作為陽性對照，用已知不含魚類成分的樣品作陰性對照，用等體積的水代替模板DNA作空白對照。

C.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增：

94-95℃?2-4min，1個循環；

94-95℃?10-60s，61℃10-60s，共40個循環；

95℃15s，60℃15s，20min內升溫至95℃，95℃15s。

(3)使用熔解曲線分析PCR擴增結果。

金槍魚擴增產物溶解曲線的峰值在83±0.5℃和89±0.5℃出現雙峰。

本發明建立了金槍魚種源的實時熒光PCR檢測方法及檢測方法。本發明采用實時熒光PCR技術，該技術特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復雜的魚肉制品中金槍魚種源的檢測。

附圖說明

圖1是實施例1中金槍魚樣品PCR產物的熔解曲線圖。

圖2是實施例2中金槍魚樣品PCR產物的熔解曲線圖。