[發明專利]假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201010149905.7
• 申請日: 2010-04-16
• 公開（公告）號: CN101851280A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 王楠;潘春剛;李剛強;劉德虎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所;中牧實業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C12N15/31;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;A61K38/16;A61P31/00;A61P31/04;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

1.一種假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

2.編碼權利要求1所述假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因。

3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的DNA序列如SEQ?ID?No.3所示。

4.一種含有編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的DNA序列的表達載體，其包括酵母誘導型啟動子，位于啟動子下游的編碼α-因子分泌信號肽的核苷酸序列以及權利要求2或3所述編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因，所述編碼假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的基因的5’端具有酵母Kex2基因表達產物切割識別序列GAGAAAAGA。

5.根據權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述酵母誘導型啟動子為酵母醇氧化酶啟動子。

6.根據權利要求4或5所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體的出發載體為pPIC9K。

7.一種基因工程菌，其為含有權利要求4-6任一項所述表達載體的宿主；優選地，所述宿主為畢赤酵母；更優選地，所述宿主為畢赤酵母GS115。

8.權利要求7所述基因工程菌的培養和表達方法，該方法包括如下步驟：

1)菌體培養：在基礎發酵培養基中發酵培養，接種前用氨水調節培養基的pH值為5.7～6.0，然后在每升基礎發酵培養基中加入4.37mL?PTM1溶液；按體積比10％的比例接入種子液，28～30℃、372～380轉/分通氣攪拌培養22～24小時；

2)飼喂碳源：通過蠕動泵向步驟1)得到的發酵液中流加含有12mL?PTM1/L發酵液的50％甘油，流加量為17～18mL/h/L發酵液，28～30℃通氣攪拌培養4～5小時，在培養過程中加入氨水調節pH值為5.7～6.0，調整通氣量使溶氧量大于20％；

3)誘導表達：向步驟2)得到的發酵液中流加含有12mL?PTM1/L發酵液的甲醇，使甲醇的濃度為0.2～0.3％，調整通氣量使溶氧量大于20％，28～30℃通氣攪拌培養120～144小時；

其中，所述基礎發酵培養基為10×Basal?Salts+4％甘油；所述PTM1含有0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素和0.5％硫酸。

9.一種在重組畢赤酵母中表達假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白的方法，該方法包括如下步驟：利用權利要求4-6任一項所述的表達載體轉化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經過發酵培養，分泌產生假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白。

10.假黑盤菌素成熟多肽二聚體融合蛋白在制備殺滅病原性細菌和耐藥性菌株的藥物中的應用。