[發明專利]單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201010148950.0
• 申請日: 2010-04-17
• 公開（公告）號: CN101805799A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發明（設計）人: 史賢明;張丹丹;龍飛;王大鵬;施春雷
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種食品安全技術領域的試劑盒及檢測方法，具體是一種單核細胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes)熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

李斯特菌是革蘭氏陽性無芽孢桿菌，該屬內共有7種菌(單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、綿羊李斯特菌(L.ivanovii)、墨氏李斯特菌(L.murrayi)、西爾李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、威爾氏李斯特菌(L.welshimeri)、英諾克李斯特菌(L.innocua))，其中僅單核細胞增生李斯特菌對人有致病性，是一種人畜共患病的病原菌，中毒癥狀嚴重，除了常見的嘔吐、腹瀉等胃腸道表現外，還可以侵蝕人體中樞神經系統(主要表現為敗血癥、腦膜炎、流產等疾病)，對機體造成極大的傷害。人類李斯特菌病的大多數病例分為零散性發生，爆發性發生或二者兼而有之。其發病率雖不高，但致死率可高達20％～30％。孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者是易感人群。它在自然界廣泛分布，蔬菜、乳制品、海產品、肉類和禽類等食品中都已證實是李斯特菌的傳播載體，它可在4℃的環境中生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。

近年發展起來的熒光定量PCR(Fluorescence?Quantitative，FQ-PCR)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(如Walker?CG，Meier?S，Mitchell?MD等在《BMC?Molecular?Biology》(BMC分子生物學)2009年第10卷第100頁發表的題為《Evaluationof?real-time?PCR?endogenous?control?genes?for?analysis?of?gene?expression?in?bovineendometrium》(實時熒光定量PCR法分析牛子宮內膜內源控制基因的表達)一文中所述的)和病原體的定性定量檢測(如Zago?M，Bonvini?B，Carminati?D等在《Systematic?and?AppliedMicrobiology》(系統與應用微生物學)2009第32卷第514～521頁發表的題為《Detection?andquantification?of?Enterococcus?gilvus?in?cheese?by?real-time?PCR》(熒光定量PCR法定性定量檢測奶酪中的腸球菌)一文中所述的)等方面得到廣泛應用。

經對現有技術的文獻檢索發現，陳慧燕等發表于《中國熱帶醫學》2006年第6卷第770～772頁的題為《食品中李斯特菌檢測方法探討及藥敏結果分析》的文章。該技術通過對8類食品45件樣品的檢測，其采用的國標法以及改良方法需要制備培養基、計算菌落數量和鑒定菌落的生化特性等，耗時較長，操作繁瑣；其采用的Mini?VIDAS法檢出率較低，檢測靈敏度不高。因此該現有技術并不適合當前食品快速檢測的需求。

目前常規鑒定單核細胞增生李斯特菌的方法以常規培養方法為主(可見標準GB/T4789.30-2003)，根據生化特性、致病力及協同溶血試驗等進行鑒定，鑒定周期需要5～10天。免疫學方法較快，但單克隆抗體制備困難，易產生交叉反應，特異性差。常規PCR方法雖然具有簡便、快速、靈敏的優勢，但是有不能精確定量和PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題，因此亟待開發精確、靈敏、快速、無污染的快速檢測方法。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。本發明的試劑盒可用于單核細胞增生李斯特菌的定性和定量檢測；本發明的試劑盒檢測特異性高，檢測靈敏度高，定量準確，檢測速度快。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明涉及一種單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包括：熒光定量PCR反應液、熒光探針、熱啟動TaqDNA聚合酶、標準陽性模板和陰性質控標準品；

所述的熒光定量PCR反應液具體為：10×PCR?buffer、Mg²⁺、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的堿基序列如SEQ?ID?No.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ?ID?No.2所示；

所述的熒光探針的堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示，其中，熒光報告基團為FAM，熒光淬滅基團為ELIPCE；

所述的標準陽性模板為重組質粒的DNA，該重組質粒的質粒為pMD18-T，整合的基因的堿基序列如SEQ?ID?No.4所示；