[發明專利]單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201010148950.0
• 申請日: 2010-04-17
• 公開（公告）號: CN101805799A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發明（設計）人: 史賢明;張丹丹;龍飛;王大鵬;施春雷
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包括：熒光定量PCR反應液、熒光探針、熱啟動TaqDNA聚合酶、標準陽性模板和陰性質控標準品，其特征在于：

所述的熒光定量PCR反應液具體為：10×PCR?buffer、Mg²⁺、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的堿基序列如SEQ?ID?No.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ?ID?No.2所示；

所述的熒光探針的堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示，其中，熒光報告基團為FAM，熒光淬滅基團為ELIPCE；

所述的標準陽性模板為重組質粒的DNA，該重組質粒的質粒為pMD18-T，整合的基因的堿基序列如SEQ?ID?No.4所示；

所述的陰性質控標準品為沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA。

2.根據權利要求1所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征是，所述的熒光定量PCR反應液的組分為：按體積比，2體積的10×PCR?buffer，1體積的5μmol/L的正向引物，1體積的5μmol/L的反向引物，1.5體積的25mM的MgCl₂，1.5體積的25mM?dNTPs。

3.一種根據權利要求1所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

①采用常規方法提取待測樣品DNA為模板，

②用單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒進行PCR擴增，得反應產物，

③將反應產物置于定量PCR儀中進行熒光檢測，

④對樣品中單核細胞增生李斯特菌進行定性檢測或定量檢測。

4.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征是，所述的PCR擴增中，20μl的PCR反應體系組成如下：模板DNA?2μl，5U/μl的熱啟動TaqDNA聚合酶0.2μl，5μmol/L熒光探針0.4μl，熒光定量PCR反應液10μl，陰性質控標準品7.4μl。

5.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征是，所述的PCR反應的參數為：95℃?15S，95℃?5S，65℃?34S；45個循環。

6.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征是，所述的定性檢測為：選擇熒光檢測模式為FAM熒光，基線調整取3～15個循環的熒光信號，設定閾值線，若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈對數增長，則判斷為陽性，即樣品中存在單核細胞增生李斯特菌，否則則樣品中不存在單核細胞增生李斯特菌。

7.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征是，所述的定量檢測為：設定梯度濃度的標準陽性模板，采用與PCR擴增相同的反應體系和參數進行PCR擴增，以標準陽性模板的對數值為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線，根據樣品測得的Ct值，對照標準曲線，得到樣品單核細胞增生李斯特菌的含量。