[發明專利]利用昆蟲系統表達白藜蘆醇芪合酶和制備白藜蘆醇的方法

有效

• 申請號: 201010148076.0
• 申請日: 2010-04-15
• 公開（公告）號: CN102220350A
• 公開（公告）日: 2011-10-19
• 發明（設計）人: 呂正兵;高然;葉甫云
• 申請（專利權）人: 上海科愛生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/866;C12N7/01;C12N9/00;C12P7/22
• 代理公司: 上海衡方知識產權代理有限公司 31234
• 代理人: 卞孜真

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種從昆蟲表達系統表達的白藜蘆醇芪合酶制備白藜蘆醇的方法，即利用昆蟲系統表達的白藜蘆醇合成的關鍵酶(芪合酶)，以西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮等的提取液為底物在體外合成白藜蘆醇的方法。

背景技術

白藜蘆醇藥用價值的研究越來越受到國內外學者的青睞，Jang等在Science雜志上對白藜蘆醇在癌癥的始發、促進及發展階段表現出的抑制作用進行了系列報道，從而使白藜蘆醇成為癌癥化學預防和化學治療領域的一個研究熱點。

體外試驗證實白藜蘆醇可以抑制血小板功能和內皮細胞TF的表達，從而減少血栓形成。體外試驗還證實白藜蘆醇由于抑制了類花生酸的合成和血小板鈣通道，從而抑制了由血栓素、ADP和膠原誘導的血小板聚集。在誘發心血管疾患的內皮源性介質中，21個氨基酸的內皮素21(ET21)是一個重要的先行分子。白藜蘆醇已被發現可作為ET21的拮抗劑，可以拮抗ET21對大鼠的殺傷效應，并能夠抑制由ET21所致的血壓升高。在高膽固醇血癥的兔子模型中，白藜蘆醇可減少血漿ET21水平，并顯著升高NO水平。這些研究結果顯示白藜蘆醇可改善內皮細胞功能，也是白藜蘆醇發揮非酒精依賴性的心血管保護效應的機制之一。

Orgogozo等調查后發現，經常飲用紅葡萄酒的老年人罹患老年癡呆病的幾率顯著下降，推測紅酒具有神經保護作用。之后，大量實驗證實白藜蘆醇是紅葡萄酒中發揮神經保護作用的主要物質，研究發現，白藜蘆醇可以標識激酶和神經細胞，通過葡萄酒攝入白藜蘆醇，對于老年人的退化病，如帕金森癥、癡呆癥、風濕性疾病都有較好的預防和治療作用。

多羥基芪類物質大都具有抗氧化、抗自由基作用。研究證明，白藜蘆醇具有抗氧化、抗自由基及影響花生四烯酸代謝的藥理作用。這也是其具有多重生物學效應的重要機制之一。有研究表明，白藜蘆醇能顯著抑制肝微粒體、腦線粒體及突觸體氧化損傷過程中DNA的生成，對病毒性肝炎、帕金森病、阿爾茨海默病等疾病有很好的防治作用。

白藜蘆醇及白藜蘆醇苷對脂質過氧化有很強的抑制作用，能降低血清和肝臟的脂質，減少脂質過氧化物在體內的堆積，保護肝臟不受損害。另外，白藜蘆醇還能通過選擇性下調細胞周期蛋白cyclinD1的表達，使星狀細胞靜止在G1期，從而有利于抑制肝纖維化的形成。

綜上所述，白藜蘆醇具有多方面有益于人類健康的生物藥理活性，使其廣泛應用于醫藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領域。其在腫瘤、心腦血管疾病、癡呆、病毒性肝炎、炎癥疾病等方面的治療及預防作用也越來越被人們認識，其臨床應用前景廣闊，有望成為一種可防治多種疾病的新型藥物。然而，白藜蘆醇市場售價極為昂貴，而且不宜為大多數人所利用。

白藜蘆醇的獲得可以通過化學合成法得到，然而現有的化學合成方法，如Wittig法和Wittig-Horner法、Perkin反應法、Heck反應法等都存在著產物的順反異構選擇性不高，收率低，生成的副產難以除去，合成路線步驟繁多等缺陷；在生物合成中一般原核表達載體產生的目的蛋白生物活性極低或無生物活性，植物表達系統一般產量低，周期長，難以大規模投入生產，更難以滿足市場需要；而酵母和動物表達系統生產藥物成本極高，產量極低，也存在相同的問題。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統是近年來一種發展迅速的高效、便捷的新型真核表達系統。通過位點特異的轉座可方便地將外源基因插入到桿狀病毒穿梭載體上，然后提取含有外源基因的重組Bacmid，將其轉染入昆蟲細胞即可獲得含有外源基因的重組病毒用于表達目的蛋白。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統已在各領域得到廣泛運用，受到廣泛關注。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統經過多年的發展，已分化出面向苜蓿銀紋夜蛾桿狀態病毒(Autographa?californica?multiple?nuclear?polyhedrosis?virus，AcMNPV)、家蠶桿狀病毒(Bombyxmori?nuclear?polyhedrosis?virus，BmNPV)和棉鈴蟲桿狀病毒(Helicoverpa?armigera?nuclearpolyhedrosis?virus，HaNPV)的3個子系統。AcMNPV的Bac-to-Bac系統發展最早，研究也最深入，對其他兩個系統的發展影響很大。近年來，Invitrogen公司應用Bac-to-Bac策略已開發出面向AcMNPV的表達系統。該系統中，Bacmid包含有mini2F復制子、卡那霉素抗性篩選標記和細菌轉座子Tn7的靶位點(mini-attTn7)以及編碼β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。