[發(fā)明專(zhuān)利]利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)白藜蘆醇芪合酶和制備白藜蘆醇的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010148076.0
• 申請(qǐng)日: 2010-04-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102220350A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂正兵;高然;葉甫云
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海科愛(ài)生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/52
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/52;C12N15/866;C12N7/01;C12N9/00;C12P7/22
• 代理公司: 上海衡方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31234
• 代理人: 卞孜真

1.一種利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)白藜蘆醇芪合酶制備的方法，包括：

1)通過(guò)RT-PCR從葡萄組織中獲得白藜蘆醇芪合酶基因，并在其5’端加上BamH?I酶切位點(diǎn)，3’端加上Sal?I酶切位點(diǎn)，獲得重組基因；

2)把步驟1)獲得的重組基因經(jīng)BamH?I和Sal?I雙酶切后與pFastBac?HTA質(zhì)粒載體連接并獲得重組pFastBac?HTA-llcjy質(zhì)粒；

3)把步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH?10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

4)經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取含有重組Bacmid的白色菌落，提取重組Bacmid?DNA；

5)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組病毒，保藏號(hào)CGMCC3673；

6)重組病毒的鑒定及大量擴(kuò)增；

7)重組病毒接種家蠶蛹，28℃±2℃反應(yīng)5到7天，即獲得大量表達(dá)白藜蘆醇芪合酶的工程蠶蛹；

8)蠶蛹用0.85wt％生理鹽水按重量比1∶1混和后勻漿，然后多次離心后用G150分子篩純化并脫鹽后獲得重組白藜蘆醇芪合酶。

2.如權(quán)利要求1所述的利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)白藜蘆醇芪合酶制備的方法，其特征是所述RT-PCR的上游引物為5′-GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGGTCCGGC，下游引物為5′-GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC。

3.如權(quán)利要求1所述的利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)白藜蘆醇芪合酶制備的方法，其特征是所述藍(lán)白斑篩選選擇含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的固體培養(yǎng)基。

4.如權(quán)利要求1所述的利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)白藜蘆醇芪合酶制備的方法，其特征是所述的重組白藜蘆醇芪合酶如SEQ?ID?No2。

5.一種白藜蘆醇的制備方法，包括：

1)在30℃下，把按權(quán)利要求1所述利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)白藜蘆醇芪合酶制備的方法制得的白藜蘆醇芪合酶與西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮及葡萄籽的提取液反應(yīng)6～8小時(shí)，獲得反應(yīng)混合物；

2)反應(yīng)混合物用大孔樹(shù)脂純化。

6.如權(quán)利要求4所述的白藜蘆醇的制備方法，其特征是所述大孔樹(shù)脂純化的方法為使用中極性的粒徑在0.30～1.25mm的大孔樹(shù)脂DM-130進(jìn)行富集，在常溫條件下，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的乙醇作解吸劑，以2.0mL/min的流速對(duì)已吸附了樣品的白藜蘆醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，獲得的洗脫液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去除有機(jī)溶劑，并冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗制品。