[發(fā)明專利]以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞,體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010146946.0
• 申請日: 2010-04-12
• 公開（公告）號: CN101829362A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 衛(wèi)小春;段王平;孫振偉;李琦
• 申請（專利權(quán)）人: 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院;衛(wèi)小春
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/20
• 代理公司: 山西太原科衛(wèi)專利事務(wù)所 14100
• 代理人: 張彩琴;任林芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組織工程化軟骨體外構(gòu)建的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)

在組織工程化軟骨體外構(gòu)建過程中，理想種子細(xì)胞的選擇最為關(guān)鍵，也是目前研究的難點(diǎn)。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中，最為常用的關(guān)節(jié)軟骨組織工程的種子細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。其體外常規(guī)酶解消化方法為：0.4％Pronase酶按12mLDMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨37℃消化90分鐘，更換培養(yǎng)液后，0.025％II型膠原酶過夜消化，獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。但軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及傳代過程中，黏彈性逐漸降低，脆性增加，軟骨細(xì)胞功能退變比較快，體內(nèi)修復(fù)軟骨缺損過程中形不成符合正常軟骨特性的透明軟骨組織，成為制約組織工程技術(shù)發(fā)展的最大障礙之一。

軟骨單位(Chondron)作為近年來才逐漸重視的關(guān)節(jié)軟骨功能結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞周基質(zhì)及包裹在一個或幾個軟骨細(xì)胞共同構(gòu)成，其在軟骨細(xì)胞代謝及力學(xué)環(huán)境維持方面發(fā)揮了重要作用。我們試圖在體外成功酶解消化獲取兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位的基礎(chǔ)上，以其為種子細(xì)胞，建立體外體外構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的實(shí)驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有以軟骨細(xì)胞為組織工程化軟骨種子細(xì)胞的不足，提出一種新的關(guān)節(jié)軟骨組織工程的種子細(xì)胞——軟骨單位(Chondron)的體外獲取方法及其體外組織工程化軟骨的構(gòu)建技術(shù)。具體是一種兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位體外酶解消化、分離方法的基礎(chǔ)上，以軟骨單位為種子細(xì)胞，以海藻酸鈉凝膠為載體，建立體外構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的實(shí)驗(yàn)方法。

本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種以兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于步驟如下：

(1)、無菌條件下留取兔膝關(guān)節(jié)，在超凈工作臺內(nèi)將膝關(guān)節(jié)打開，刮取膝關(guān)節(jié)股骨和脛骨平臺全層軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨反復(fù)剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用；

(2)、采用dispase酶和II型膠原酶按12mL?DMEM-F12培養(yǎng)液/g軟骨加入上述錐形瓶內(nèi)，即每克軟骨加入DMEM-F12培養(yǎng)液12mL，DMEM-F12培養(yǎng)液中含有質(zhì)量/體積濃度為0.3％的dispase酶和質(zhì)量/體積濃度為0.2％的II型膠原酶，

上述兩種酶均采用無菌DMEM-F12培養(yǎng)液溶解，經(jīng)過0.22μm一次性過濾器過濾、除菌，

加入培養(yǎng)液的錐形瓶放置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進(jìn)行聯(lián)合酶解攪拌消化3h，形成消化懸液；

(3)、將上述消化懸液用100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾于離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，然后10mL無菌DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗、離心3次，加入原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液包括DMEM-F12培養(yǎng)基9mL及肽牛血清1mL，制成無菌的軟骨單位懸液，即獲得了種子細(xì)胞——軟骨單位；

(4)、上述獲得的軟骨單位進(jìn)行海藻酸鈉凝膠立體培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程軟骨，步驟如下：

①、將120mg海藻酸鈉粉劑溶解于10mL0.9％NaCl溶液，振蕩，混勻，0.45μm一次性過濾器過濾、除菌備用，

②、將軟骨單位懸液計數(shù)、離心，棄上清，按4×10⁶個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合，用無菌吸管反復(fù)吹打均勻，

③、用微量移液器吸取40μL混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl₂溶液，靜置5～10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球，0.9％NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養(yǎng)，每孔接種4粒凝膠球，加入原代培養(yǎng)基3mL，原代培養(yǎng)基包括DMEM-F12培養(yǎng)基2.7mL及肽牛血清0.3mL。

④、將培養(yǎng)板放置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，2～3日更換1次培養(yǎng)液，使關(guān)節(jié)軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩(wěn)定生長。

本發(fā)明利用軟骨單位作為組織工程化軟骨種子細(xì)胞，相對現(xiàn)有技術(shù)具有如下有益效果：

(1)、利用dispase酶和II型膠原酶聯(lián)合酶解攪拌消化3小時可以成功獲取兔膝關(guān)節(jié)軟骨單位，獲取方法簡單，重復(fù)性好。

(2)、酶解消化獲得的軟骨單位包括完整的細(xì)胞周基質(zhì)及包裹在內(nèi)的一個或幾個軟骨細(xì)胞，使得軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)及構(gòu)建組織工程化軟骨過程中更加符合軟骨細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境及生物學(xué)特性。