[發明專利]以兔膝關節軟骨單位為種子細胞,體外構建組織工程軟骨的實驗方法

無效

• 申請號: 201010146946.0
• 申請日: 2010-04-12
• 公開（公告）號: CN101829362A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 衛小春;段王平;孫振偉;李琦
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學第二醫院;衛小春
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/20
• 代理公司: 山西太原科衛專利事務所 14100
• 代理人: 張彩琴;任林芳

1.一種以兔膝關節軟骨單位為種子細胞，體外構建組織工程軟骨的實驗方法，其特征在于步驟如下：

(1)、無菌條件下留取兔膝關節，在超凈工作臺內將膝關節打開，刮取膝關節股骨和脛骨平臺全層軟骨，將關節軟骨反復剪成碎片組織，無菌D-Hanks液沖洗，棄上清，稱重，放置于無菌錐形瓶備用；

(2)、采用dispase酶和II型膠原酶按12mL?DMEM-F12培養液/g軟骨加入上述錐形瓶內，即每克軟骨加入DMEM-F12培養液12mL，DMEM-F12培養液中含有質量/體積濃度為0.3％的dispase酶和質量/體積濃度為0.2％的II型膠原酶，

上述兩種酶均采用無菌DMEM-F12培養液溶解，經過0.22μm一次性過濾器過濾、除菌，

加入培養液的錐形瓶放置于37℃5％CO₂培養箱中磁力攪拌器上，慢速攪拌，進行聯合酶解攪拌消化3h，形成消化懸液；

(3)、將上述消化懸液用100μm細胞篩網過濾于離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，然后10mL無菌DMEM-F12培養液反復沖洗、離心3次，加入原代軟骨細胞培養液10mL，原代軟骨細胞培養液包括DMEM-F12培養基9mL及肽牛血清1mL，制成無菌的軟骨單位懸液，即獲得了種子細胞——軟骨單位；

(4)、上述獲得的軟骨單位進行海藻酸鈉凝膠立體培養，體外構建組織工程軟骨，步驟如下：

①、將120mg海藻酸鈉粉劑溶解于10mL0.9％NaCl溶液，振蕩，混勻，0.45μm一次性過濾器過濾、除菌備用，

②、將軟骨單位懸液計數、離心，棄上清，按4×10⁶個單位/mL海藻酸鈉凝膠混合，用無菌吸管反復吹打均勻，

③、用微量移液器吸取40μL混合均勻的海藻酸鈉凝膠，緩慢滴入無菌102mMCaCl₂溶液，靜置5～10分鐘，制成海藻酸鈉凝膠球，0.9％NaCl溶液蘸洗，接種于6孔板培養，每孔接種4粒凝膠球，加入原代培養基3mL，原代培養基包括DMEM-F?12培養基2.7mL及肽牛血清0.3mL，

④、將培養板放置于37℃5％CO₂培養箱進行培養，2～3日更換1次培養液，使關節軟骨單位在海藻酸鈉凝膠穩定生長。