[發明專利]利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法

無效

• 申請號: 201010146740.8
• 申請日: 2010-04-09
• 公開（公告）號: CN101851648A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發明（設計）人: 黃捷;程元榮;楊國新;金東偉;余輝;李夸良;陳夏琴;陳有鐘
• 申請（專利權）人: 福建省微生物研究所
• 主分類號: C12P17/14
• 分類號: C12P17/14;C07D498/18;C12R1/11
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 丁秀麗

1.一種利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法。其特征在于：將巨大芽孢桿菌接種于斜面培養基培養后，再接入種子培養基培養，然后將種子液接入轉化培養基；待巨大芽孢桿菌在轉化培養基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，經過巨大芽孢桿菌對雷帕霉素的轉化，獲得巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液，轉化液中包含29，42-O-雙去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。

2.根據權利要求1所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的斜面培養基為營養瓊脂、沙保羅瓊脂、高氏1號瓊脂、精氨酸瓊脂和ISP3瓊脂；巨大芽孢桿菌在斜面培養基中的生長條件為pH5.5～8.0，生長溫度20～40℃，培養時間15～24小時。

3.根據權利要求1所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的種子和轉化培養基均為：碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、糊精等等任意一種或2～3種搭配使用，100毫升培養基中含碳源2～5克；氮源可以為黃豆粉、黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、棉籽粉等任意一種或2～3種搭配使用，100毫升培養基含氮源0.5～2克；無機鹽選擇硝酸鈉、硝酸鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化銨、硝酸銨、鉬酸銨、硫酸鋅、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等任意一種或2～3種搭配使用，100毫升培養基中無機鹽0.1～0.2克；種子培養過程采用的pH6.0～8.0，培養溫度20～40℃；轉化過程采用的pH5.0～6.5，溫度26～32℃；移種量為1～5％。

4.根據權利要求2或3所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適種子和轉化培養基均為1000毫升培養基含可溶性淀粉24克、葡萄糖1克、蛋白胨3克、酵母浸出物3克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0.5克，pH自然。

5.根據權利要求4所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適種子培養條件為pH6.5～7.5，溫度28℃，培養時間：一級種子15～18小時，二級種子8～10小時，移種量為2～3％。

6.根據權利要求5所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適轉化培養條件為pH5.5～6.0，溫度28℃，加入轉化底物雷帕霉素后，轉化周期63～65小時。

7.根據權利要求6所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素時使用的轉化底物雷帕霉素事先溶解在二甲亞砜、甲醇或乙醇中，雷帕霉素母液濃度10～20mg/ml，最適終濃度為125μg/ml。

8.根據權利要求7所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：在100毫升轉化培養基中添加表面活性劑0.01～1克，所述的表面活性劑為聚乙烯醇、水溶性維生素E、吐溫80、吐溫20、泊洛沙姆等的任意一種；或采用雙水相系統，所述的雙水相系統為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000等分別與磷酸鹽組成的雙水相系統；聚乙二醇系列與聚乙烯吡咯烷酮組成的雙水相系統；聚乙二醇濃度5～20％；磷酸鹽濃度為1～3％；聚乙烯吡咯烷酮濃度5～15％。

9.根據權利要求8所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液用乙酸乙酯以1∶1～2體積比萃取2次，每次10～20分鐘，將萃取液50～55℃減壓濃縮至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50～55℃減壓濃縮至干；從轉化液中將3個去甲基雷帕霉素分離開來，用葡聚糖葡聚糖凝膠LH-20為填料進行柱層析，氯仿洗脫；也可用0DSC18反向硅膠為填料進行柱層析，乙腈/水系統洗脫，出峰順序為29，42-O-雙去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素；通過上述柱層析，收集到的3個去甲基雷帕霉素純度均可達90％以上；接著，以300～400目硅膠為填料，以丙酮/正己烷為流動相進行柱層析，獲得純度＞98％的3個去甲基雷帕霉素。