[發(fā)明專利]利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010146740.8
• 申請日: 2010-04-09
• 公開（公告）號: CN101851648A
• 公開（公告）日: 2010-10-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃捷;程元榮;楊國新;金東偉;余輝;李夸良;陳夏琴;陳有鐘
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省微生物研究所
• 主分類號: C12P17/14
• 分類號: C12P17/14;C07D498/18;C12R1/11
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 丁秀麗

1.一種利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法。其特征在于：將巨大芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后將種子液接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；待巨大芽孢桿菌在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，經(jīng)過巨大芽孢桿菌對雷帕霉素的轉(zhuǎn)化，獲得巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液中包含29，42-O-雙去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的斜面培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂、沙保羅瓊脂、高氏1號瓊脂、精氨酸瓊脂和ISP3瓊脂；巨大芽孢桿菌在斜面培養(yǎng)基中的生長條件為pH5.5～8.0，生長溫度20～40℃，培養(yǎng)時間15～24小時。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的種子和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基均為：碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、糊精等等任意一種或2～3種搭配使用，100毫升培養(yǎng)基中含碳源2～5克；氮源可以為黃豆粉、黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、棉籽粉等任意一種或2～3種搭配使用，100毫升培養(yǎng)基含氮源0.5～2克；無機鹽選擇硝酸鈉、硝酸鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化銨、硝酸銨、鉬酸銨、硫酸鋅、硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等任意一種或2～3種搭配使用，100毫升培養(yǎng)基中無機鹽0.1～0.2克；種子培養(yǎng)過程采用的pH6.0～8.0，培養(yǎng)溫度20～40℃；轉(zhuǎn)化過程采用的pH5.0～6.5，溫度26～32℃；移種量為1～5％。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素的最適種子和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基均為1000毫升培養(yǎng)基含可溶性淀粉24克、葡萄糖1克、蛋白胨3克、酵母浸出物3克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0.5克，pH自然。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素的最適種子培養(yǎng)條件為pH6.5～7.5，溫度28℃，培養(yǎng)時間：一級種子15～18小時，二級種子8～10小時，移種量為2～3％。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素的最適轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件為pH5.5～6.0，溫度28℃，加入轉(zhuǎn)化底物雷帕霉素后，轉(zhuǎn)化周期63～65小時。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素時使用的轉(zhuǎn)化底物雷帕霉素事先溶解在二甲亞砜、甲醇或乙醇中，雷帕霉素母液濃度10～20mg/ml，最適終濃度為125μg/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：在100毫升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加表面活性劑0.01～1克，所述的表面活性劑為聚乙烯醇、水溶性維生素E、吐溫80、吐溫20、泊洛沙姆等的任意一種；或采用雙水相系統(tǒng)，所述的雙水相系統(tǒng)為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000等分別與磷酸鹽組成的雙水相系統(tǒng)；聚乙二醇系列與聚乙烯吡咯烷酮組成的雙水相系統(tǒng)；聚乙二醇濃度5～20％；磷酸鹽濃度為1～3％；聚乙烯吡咯烷酮濃度5～15％。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化雷帕霉素的轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯以1∶1～2體積比萃取2次，每次10～20分鐘，將萃取液50～55℃減壓濃縮至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50～55℃減壓濃縮至干；從轉(zhuǎn)化液中將3個去甲基雷帕霉素分離開來，用葡聚糖葡聚糖凝膠LH-20為填料進行柱層析，氯仿洗脫；也可用0DSC18反向硅膠為填料進行柱層析，乙腈/水系統(tǒng)洗脫，出峰順序為29，42-O-雙去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素；通過上述柱層析，收集到的3個去甲基雷帕霉素純度均可達90％以上；接著，以300～400目硅膠為填料，以丙酮/正己烷為流動相進行柱層析，獲得純度＞98％的3個去甲基雷帕霉素。