[發(fā)明專利]一種生物素蛋白連接酶融合蛋白

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010146660.2
• 申請(qǐng)日: 2010-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN102190730A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雷建強(qiáng);叢薇;袁靖宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海澤潤生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海天翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 王裕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物素蛋白連接酶融合蛋白、基因、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體及其制備方法。

背景技術(shù)

生物素蛋白連接酶(EC?6.3.4.15)能活化生物素形成生物酰5′腺苷酸，再將生物素轉(zhuǎn)移到生物素受體蛋白上，同時(shí)也是生物素的操縱子的抑制物，由birA基因編碼。生物素蛋白連接酶廣泛存在于原核生物和真核生物的體內(nèi)，又可以稱為生物素連接酶、生物素操縱子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶，而存在于原核細(xì)胞的生物素蛋白連接酶又名BirA酶。

大腸桿菌中BirA酶蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中其N端60個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)螺旋轉(zhuǎn)螺旋的結(jié)構(gòu)，此為DNA結(jié)構(gòu)域，而中間區(qū)域形成催化域，其C端結(jié)構(gòu)尚未確定。分子量約為35KD。在大腸桿菌中，BirA酶僅識(shí)別并生物素化一種蛋白質(zhì)類型，即乙酰基-CoA羧基酶的亞基生物素羧基載體蛋白(biotin?carboxyl?carrier?protein，BCCP)，由于其生物素化的能力，BirA酶作為一種重要的試劑已廣泛用于蛋白質(zhì)分子之間相互作用的研究，特別是細(xì)胞表面受體-配體相互作用的研究。通過在目的蛋白上加入1個(gè)能被BirA酶識(shí)別的肽序列(可生物素化的序列BSP：Leu-His-His-Ile-Leu-Asp-Ala-Gln-Lys-Met-Val-Trp-Asn-His-Arg)，BirA酶可將生物素結(jié)合到目的蛋白上，這樣就可用標(biāo)記的親和素探測目的蛋白。雖然BirA酶是大腸桿菌的固有成分，但現(xiàn)有商品化的BirA酶價(jià)格昂貴且活性不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種廉價(jià)的、酶活高的生物素蛋白連接酶融合蛋白及其制備方法。

為此，本發(fā)明公開了一種如下(a)或(b)的生物素蛋白連接酶融合蛋白：

(a)其氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列，其N端為多聚堿性氨基酸的蛋白；

(b)至少與SEQ?ID?NO.1所述氨基酸序列90％同源性、N端為多聚堿性氨基酸且具有生物素蛋白連接酶活性的蛋白。

在一實(shí)施方式中，所述多聚堿性氨基酸為多聚組氨酸，其中優(yōu)選6聚組氨酸。

在一實(shí)施方式中，所述生物素蛋白連接酶融合蛋白為SEQ?ID?NO.2所述氨基酸序列。

另一方面，本發(fā)明公開了一種編碼本發(fā)明所述生物素蛋白連接酶融合蛋白多核苷酸分子。

另一方面，本發(fā)明公開了一種包含本發(fā)明所述多核苷酸分子的重組表達(dá)載體。

另一方面，本發(fā)明公開了一種包含本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。

在一實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌BL21。

另一方面，本發(fā)明公開了所述生物素蛋白連接酶融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

①生物素蛋白連接酶融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建；

②生物素蛋白連接酶融合蛋白轉(zhuǎn)化體的制備；

③生物素蛋白連接酶融合蛋白的表達(dá)；

④生物素蛋白連接酶融合蛋白的純化。

在一實(shí)施例中，步驟④采取金屬螯合柱純化，優(yōu)選為鎳離子金屬螯合柱純化。

本發(fā)明所述生物素蛋白連接酶融合蛋白比現(xiàn)有商業(yè)化的BirA酶的活性高出約1倍左右，所述的制備方法工藝簡單、產(chǎn)量高。

附圖說明

圖1為PCR產(chǎn)物電泳圖；

圖2為pET32-BirA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳；

圖3為BirA1菌種大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)物SDS-PAGE電泳；

圖4為純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳；

圖5為BirA酶活曲線圖；

具體實(shí)施方式

在本文，術(shù)語所述“生物素蛋白連接酶”(Biotin?Ligase、BirA、EC6.3.4.15)，能活化生物素形成生物酰5′腺苷酸，再將生物素轉(zhuǎn)移到生物素受體蛋白上，同時(shí)也是生物素的操縱子的抑制物，由birA基因編碼。生物素-蛋白連接酶廣泛存在于原核生物和真核生物的體內(nèi)，又可以稱為生物素連接酶、生物素操縱子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶，而存在于原核細(xì)胞的生物素蛋白連接酶又名BirA酶。大腸桿菌BirA酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所述，同類生物素蛋白連接酶有90％的同源性，其生物學(xué)作用沒有種屬特異性。