[發(fā)明專利]熒光定量PCR檢測(cè)馬秋波病毒的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010146462.6
• 申請(qǐng)日: 2010-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN101805802A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚李四;燕清麗;張曉龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種利用熒光定量PCR檢測(cè)馬秋波病毒的方法。

背景技術(shù)

馬秋波病毒(machupo?virus，MACV)屬于沙粒病毒屬(Arenavirus)， 有包膜，毒粒呈多型性，大小為80～150nm。1963年首次在玻利維亞委內(nèi) 瑞拉暮鼠(Calomys?callosus)中分離到的。病毒基因組為單負(fù)鏈RNA雙 環(huán)，分節(jié)段，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制。幾乎所有的沙粒病毒都能引起嚙齒類動(dòng)物 持續(xù)性感染。馬秋波病毒被視為沙粒病毒屬中新世界病毒的代表之一。 它與胡寧病毒(Junin)、瓜納里托病毒(Guanarito)是引起人出血熱重要病 毒，主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、乏力、肌肉酸痛、厭食等，3-4天后會(huì)伴隨頭 痛頭暈、惡心和嚴(yán)重衰竭，潛伏期在1-2周。其高致病性和致死率不低于 30％。

雖然，我國(guó)還未發(fā)現(xiàn)感染馬秋波病毒的病例存在，但是隨著全球經(jīng) 濟(jì)一體化和貿(mào)易自由化，國(guó)外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過先進(jìn)的交通工具和國(guó) 際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一個(gè)國(guó)家或地區(qū)傳向全球，造成國(guó)際間傳 播。傳染病在國(guó)際間的廣泛傳播與流行，已成為各國(guó)政府密切關(guān)注的政 治問題。《國(guó)際衛(wèi)生條例》、《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生檢疫法》、都對(duì)傳 染病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警與快速?zèng)Q策做出了相應(yīng)的規(guī)定。我國(guó)在“十一五”期間將傳 染病防控提升到戰(zhàn)略的角度，予以高度重視。

目前，針對(duì)外來疫病的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)技術(shù)主要采用的是免疫學(xué)檢 測(cè)及核酸檢測(cè)技術(shù)，尤其是以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測(cè)技術(shù)，能夠非 常靈敏的檢測(cè)到各種疫病病原體。但是由于PCR擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)常帶來特異 性問題，各國(guó)科學(xué)家和技術(shù)人員都在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合其它新技術(shù)， 努力改善PCR技術(shù)的特異性和敏感度。近年來，基于PCR技術(shù)及ABI Taqman探針雜交技術(shù)發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)極大地改善了傳統(tǒng) PCR技術(shù)的特異性和敏感性以及抗污染的能力，已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用 到各種疫病的檢驗(yàn)檢疫中。隨著探針技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善，一種新型 的Hydro?Easy?Probes的出現(xiàn)，能夠有效的改進(jìn)Taqman探針本底信號(hào)高 的缺點(diǎn)，并且進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明擬采用新型Hydro?Easy Probes設(shè)計(jì)技術(shù)，開展馬秋波病毒的熒光PCR檢測(cè)試劑研究，使之成為 應(yīng)對(duì)外來疫病傳入我國(guó)的有力武器，保障人民群眾的生命安全和國(guó)家的 衛(wèi)生安全。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種馬秋波病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法。 該方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和探針對(duì)病毒 樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。檢測(cè)特異性好，靈敏度高。

本發(fā)明檢測(cè)方法首先包括獲得檢測(cè)馬秋波病毒的引物和探針的步 驟，該步驟具體為：(1)篩選馬秋波病毒S片段全長(zhǎng)序列，進(jìn)行同源性 比對(duì)，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物；(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設(shè) 計(jì)特異性探針，并提交至GENEBANK中檢測(cè)探針的特異性；(3)對(duì)待 檢測(cè)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。

在本發(fā)明上述方法中，所篩選的馬秋波病毒可以是NCBI公布的所有 馬秋波病毒S片段全長(zhǎng)序列。另外，本發(fā)明的方法中，可以利用DNASTAR 軟件進(jìn)行序列的同源性比對(duì)。比對(duì)結(jié)果見圖1。圖中陰影部分為S基因序 列高保守區(qū)。

在本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)中，首先在比對(duì)的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游 引物，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原理，在保守區(qū)之間設(shè)計(jì)上游和下游引物，其中在 上游引物的第16位存在簡(jiǎn)并性，下游引物的第14位存在簡(jiǎn)并性，設(shè)計(jì) 位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的特異的探針，其中在探針的第1位和第30位分別存在 簡(jiǎn)并性。引物和探針在合成時(shí)，探針5′端連接FAM熒光基團(tuán)，3′端連 接BHQ非熒光基團(tuán)。引物的特異性增強(qiáng)。引物和探針序列見表1。

表1

表2為利用軟件分析設(shè)計(jì)的引物和探針的參數(shù)。

表2

本發(fā)明檢測(cè)方法其次包括檢測(cè)馬秋波病毒的步驟，該步驟具體為：

(1)核酸提取

病毒RNA提取選用QIAamp?Mini?kit?52906病毒RNA提取試劑盒。

(2)RT-PCR擴(kuò)增

選用的擴(kuò)增試劑盒為ABI公司AgPath-ID^TM?One-step?RT-PCR?Kit。

反應(yīng)體系組分及其體積見表3。

表3

擴(kuò)增條件：采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件。