[發明專利]糖類的分析方法

有效

• 申請號: 201010144089.0
• 申請日: 2010-03-11
• 公開（公告）號: CN101839898A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 橫山哲雄
• 申請（專利權）人: 日本化學研究株式會社
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N21/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 馮雅;胡燁

技術領域

本發明涉及糖類的分析方法，特別是涉及采用柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法的還原糖和甘露糖-6-磷酸的分析方法。。

背景技術

作為還原糖的分析方法，已知下述方法：向將水用作流動相使試樣經液相色譜而得的洗脫液中加入含精氨酸等堿性氨基酸的硼酸水溶液，進行加熱反應后冷卻，對該反應液照射激發光并測定熒光強度或吸光度(專利文獻1)。該方法中所用的裝置是下述裝置：將液相色譜的流出管路延長，在該流路上連接含堿性氨基酸的硼酸水溶液的供給路徑，其后安裝有加熱裝置、冷卻裝置、激發光的照射裝置和熒光強度等的測定裝置。該方法中需要設置用于向經液相色譜而得的洗脫液加入含堿性氨基酸的硼酸水溶液而使其反應的供給路徑。

此外，作為上述方法的改良型，已知下述方法：使試樣經采用含作為反應試劑的精氨酸等堿性氨基酸和硼酸的流動相的液相色譜進行洗脫，加熱所得的洗脫液而使反應試劑與糖類進行反應(加熱反應)后冷卻，對該反應液照射激發光并測定熒光強度或吸光度(專利文獻2)。該方法中，因為采用含堿性氨基酸的硼酸水溶液作為液相色譜的流動相，所以不需要設置用于加入含堿性氨基酸的硼酸水溶液而使其反應的供給路徑。上述的還原糖分析法被稱為柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法。

上述的還原糖分析法都在檢測中利用了還原糖通過在硼酸的存在下與精氨酸等堿性氨基酸的加熱反應生成強熒光衍生物的特性(非專利文獻1)。該熒光衍生物是通過還原糖與作為胺化合物的堿性氨基酸的加熱反應、即美拉德反應而生成的呈褐色的類黑精，該衍生物如果受到作為激發光的波長320nm的光的照射，則發射波長430nm的光。此外，這些還原糖分析法利用了還原糖具有容易與硼酸結合而生成陰離子性配位離子的性質且該陰離子性配位離子被保持于陰離子交換色譜的特性。

柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法中，作為流動相，采用含0.01～5％的濃度的堿性氨基酸和0.05～0.5M的濃度的硼酸的水溶液(pH7～10)。這時所用的堿性氨基酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸等。另外，最近還已知作為液相色譜的流動相使用由0.1M硼緩沖液和0.4M硼酸緩沖液形成的梯度來進行糖的分離(專利文獻3、4)。

柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法中，液相色譜中的試樣洗脫在室溫～70℃的溫度下進行，而加熱反應、即美拉德反應在140～180℃進行(專利文獻2)。因為在這樣的高溫下以高硼酸濃度進行洗脫和反應，所以有時流動相中所含的硼酸會析出而堵塞管道。管道堵塞時就無法進行分析，因此必須經過管道的更換和清洗等費時費力的操作來重新開始分析。這是柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法中未解決的重要問題之一。

此外，可通過柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法分析的還原糖有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等單糖，麥芽糖、麥芽三糖等寡糖，葡糖胺、半乳糖胺等氨基糖，葡糖醛酸等糖醛酸。

作為該方法的分析對象，可以例舉糖蛋白的糖鏈。構成糖蛋白的糖鏈的還原糖有甘露糖、半乳糖、巖藻糖等中性糖和半乳糖胺等氨基糖等。糖鏈有時還包含甘露糖被1分子的磷酸修飾而得的甘露糖-6-磷酸(M6P)。

糖蛋白的糖鏈中所含的M6P具有在蛋白質被攝入細胞內時與細胞膜上的甘露糖-6-磷酸受體結合而促進該攝入的重要功能。作為糖鏈中含M6P的糖蛋白，已知局部存在于溶酶體中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)等溶酶體酶(非專利文獻2)。溶酶體酶中有使用重組技術制成的酶，被用作該酶的遺傳性缺失的患者的治療藥，例如α-半乳糖苷酶A和葡糖腦苷脂酶。溶酶體酶由于在細胞內發揮功能，因此為了使通過靜脈注射等方法給予患者的溶酶體酶發揮藥效，溶酶體酶必須被攝入患者的細胞內，因而需要在溶酶體酶的糖鏈中包含M6P。因此，進行構成這樣的酶的糖鏈的糖類時，對M6P的分析是特別重要的。柱后熒光檢測-硼酸配合物陰離子交換法可以用作各種糖類的分析技術，但尚未確立采用該方法的M6P的分析技術。

專利文獻1：日本專利特開昭58-216953號公報

專利文獻2：日本專利特開昭61-25059號公報

專利文獻3：日本專利特開2006-184131號公報

專利文獻4：日本專利特開2008-245550號公報

非專利文獻1：Mikami?H.等，《分析化學》(1983)32，E207

非專利文獻2：Bielicki?J.等，Biochem?J.(1993)289，241-246

專利文獻：

發明內容