[發明專利]β-葡聚糖酶活力的測定方法

無效

• 申請號: 201010144060.2
• 申請日: 2010-04-12
• 公開（公告）號: CN101819138A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 張永勤;葉慶國;王哲平;張洪妮;曾凡偉;張杰;王斐
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及的是一種測定β-葡聚糖酶活力的方法，具體涉及用MBTH法測定β-葡聚糖酶活力的方法尤其涉及測定過程中關鍵參數的選擇。

背景技術

β-葡聚糖是一類非淀粉類多糖，它是由β-1，3-葡萄糖苷鍵和/或β-1，4-葡萄糖苷鍵組成的鏈狀多糖，是植物細胞壁的組成成分，存在于禾谷類(包括大麥、燕麥、黑麥和小麥等)的糊粉層和胚乳細胞壁中。β-葡聚糖酶對β-葡聚糖中的糖苷鍵具有重要的水解作用。目前，該酶已廣泛用于啤酒、飼料、紡織、造紙、醫藥等行業。該酶活力的檢測方法有粘度法、熒光法、顯色底物法、凝膠擴散法、還原糖測定法等，其中最常采用的方法為還原糖測定法中的DNS法、鐵氰化鉀法和Somogyi-nelson法。由于這三種方法靈敏度較低，很難測到酶解反應的初速度，因此，準確度較差。

本發明以MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑酮腙)試劑為顯色劑來測β-葡聚糖酶的活力。該法不受低濃度醋酸鹽和丁二酸鹽緩沖液的干擾，所得酶濃度曲線與酶解反應速度在較寬的酶濃度范圍內呈線性相關。

發明內容

針對已有技術的不足，本發明提供一種β-葡聚糖酶活力的測定方法，該方法采用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法來測定β-葡聚糖酶的活力。

以下詳細介紹本發明一種β-葡聚糖酶活力的測定方法，A，制作用MBTH法測得的葡萄糖吸光度值與其相應濃度的標準對應關系曲線；B，用MBTH法檢測待測β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后產生的相當于葡萄糖的吸光度值；根據上一步驟制作的葡萄糖濃度與測得的相應吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測β-葡聚糖酶的酶解產物中在單位時間內所產生的相當于葡萄糖的還原糖的含量，以此來推算β-葡聚糖酶的活力。

優化地；上述步驟A的具體步驟是；作用MBTH法測得的葡萄糖吸光度值與其相應濃度標準對應關系曲線；分別取6-15組不同濃度(0-30μg/mL)的葡萄糖標準溶液0.6mL，加入0.6mL0.5當量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH試劑0.6mL于75-85℃水浴加熱5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1.2mL，室溫冷卻后于波長620-680nm處測定葡萄糖的吸光度值；每個濃度做三個平行樣；以上加量可按比例增減；根據每組葡萄糖濃度與測得的相應吸光度值之間的關系繪制標準對應關系曲線；

優化地；上述步驟B的具體步驟是；用MBTH法檢測β-葡聚糖酶的活力；將濃度為1-5mg/mL的預熱至測定溫度的β-葡聚糖溶液，加入至預熱至測定溫度的β-葡聚糖酶溶液中進行酶解反應，測定溫度為25-40℃，水解時間為60min以內，取水解液迅速與等體積的0.5當量的NaOH溶液充分混勻以終止反應(可在反應過程中分時間段取樣檢測)，取1.2mL加入到試管中(做三個平行樣)，再加入MBTH試劑0.6mL于75-85℃水浴加熱5-20min后趁熱加入硫酸鐵銨試劑1.2mL，室溫冷卻后于波長620-680nm處測定吸光度值，以上加量可按比例增減。根據上一步驟制作的葡萄糖的濃度與測得的相應吸光度值之間的標準對應關系曲線確定待測β-葡聚糖酶的活力；β-葡聚糖酶的活力單位可被定義為在上述條件下，每毫升反應體系中，每分鐘產生1nmol相當于葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。其中MBTH試劑的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫蘇糖醇溶液等體積混合即得，現用現配，一天內有效。

優化地；上述硫酸鐵銨試劑的制法是0.5％(FeNH₄(SO₄)₂)·12H₂O，0.5％氨基磺酸，0.5當量鹽酸。

優化地；上述β-葡聚糖以50mM的丁二酸緩沖溶液或醋酸緩沖溶液為溶劑。

優化地；上述測定吸光度值的最佳波長為650nm。

本發明的優點是本發明用MBTH法對β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖后所產生的葡萄糖端基的數量進行檢測以此來確定β-葡聚糖酶的活力；葡萄糖以及低聚β-葡聚糖是β-葡聚糖酶水解的產物，因此對葡萄糖端基含量檢測的靈敏度直接決定著對β-葡聚糖酶活力檢測的靈敏度。該方法比比濁法簡便、快速、準確、價廉。檢測限和工作濃度范圍都明顯低于DNS法和鐵氰化鉀法，所以本方法的靈敏度明顯高于DNS法和鐵氰化鉀法。

具體實施方式

實施例1：