[發明專利]精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的基因疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201010143964.3
• 申請日: 2010-04-09
• 公開（公告）號: CN101816799A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 楊曌;吳玉章
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/00;A61P15/16;C12N15/12;C12N15/85
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的基因疫苗的制備方法，其特征在 于：包括以下步驟：

a、CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體的構建：將CatSper1全長 cDNA插入含有IRES的雙基因共表達真核載體pStar的IRES上游，再將BAFF 全長cDNA插入該真核載體的IRES下游，即得CatSper1和BAFF雙基因共表 達重組真核載體；

b、免疫刺激復合物的制備：將CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載 體用磷酸鹽緩沖液即PBS溶解后，加入皂苷Quil?A，再加入膽固醇及卵磷脂， 使每毫升溶液中含有CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體0.5mg、皂 苷Quil?A?1mg、膽固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超聲處理使溶液充分混勻并 乳化，再用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISCOM，也即CatSper1的基因 疫苗。

2.根據權利要求1所述精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的基因疫苗的 制備方法，其特征在于：所述步驟a的具體方法為：

a1、CatSper1全長cDNA的克隆：提取人成熟精子細胞總RNA，逆轉錄得 到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列 為上下游引物，PCR擴增兩端分別帶有Pst?I和EcoR?I酶切位點的CatSper1全 長cDNA，PCR條件為：94℃預變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘、58℃退火 1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環，最后72℃延伸7分鐘；PCR產物經純 化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT-CatSper1；

a2、BAFF全長cDNA的克隆：提取人脾臟組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA， 再以該總cDNA為模板，以SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示序列為上下游引物， PCR擴增兩端分別帶有BamH?I和Sal?I酶切位點的BAFF全長cDNA，PCR條件 為：94℃預變性5分鐘；然后94℃變性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分鐘， 共30個循環；最后72℃延伸10分鐘；PCR產物經純化后克隆入pT-Easy載體，得 重組載體pT-BAFF；

a3、重組真核載體的構建：自步驟a1所得重組載體pT-CaSper1中用Pst?I和 EcoR?I雙酶切出CatSper1全長cDNA，經純化后與同樣用Pst?I和EcoR?I雙酶切 的真核載體pStar連接，得重組載體pStar-CatSper1；再自步驟a2所得重組載體 pT-BAFF中用BamH?I和SalI雙酶切出BAFF全長cDNA，經純化后與同樣用 BamH?I和Sal?I雙酶切的重組載體pStar-CatSper?1連接，即得CatSper?1和BAFF雙基 因共表達重組真核載體pStar-CatSper1-IRES-BAFF。