[發明專利]精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的基因疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201010143964.3
• 申請日: 2010-04-09
• 公開（公告）號: CN101816799A
• 公開（公告）日: 2010-09-01
• 發明（設計）人: 楊曌;吳玉章
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/00;A61P15/16;C12N15/12;C12N15/85
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種疫苗，特別涉及精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的 基因疫苗，還涉及該疫苗的制備方法。

背景技術

以精子抗原為基礎的疫苗開發代表了一種大有希望的避孕途徑。精子抗原 在避孕疫苗開發上的應用在于其精子特異性，參與人類生育，并可在生殖道局 部產生足以能夠終止受精的免疫應答。

CatSper1是精子特有的一種陽離子通道蛋白，特異性地表達于睪丸和附睪組 織上，主要定位于精子尾部的主段，對于精子超活化有重要的調節作用。基因 敲除試驗表明，CatSper1基因缺失小鼠的精子運動力大大降低，不能穿過透明帶 完好的卵，而且喪失受精能力。

B細胞激活因子(BAFF)是B細胞存活與成熟的必需因子，為腫瘤壞死因子 (TNF)家族成員。其能夠增強B細胞、CD4T細胞、NK細胞的活性，使機體的免 疫應答增強；還可作為T細胞激活的共刺激因子，刺激T細胞分泌干擾素-γ(IFN-γ) 和白介素-2(IL-2)，上調CD25(IL-2受體α鏈)表達，并以IL-2依賴方式促進T細胞 增生。

免疫刺激復合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil?A、膽固醇及磷脂混合后自發 形成的一種直徑為30～40nm的球形籠狀顆粒，具有佐劑和抗原遞呈的雙重功能， 可大幅度提高抗原的免疫原性。文獻報道，以ISCOM為佐劑制得的DNA疫苗 誘導的中和抗體水平和免疫保護力明顯高于裸DNA，可能的機制是經ISCOM 包裹的DNA能免受體內核酸酶的降解，從而保證該DNA在機體內持續表達。 另外，ISCOM的結構特性使其更易于定居在淋巴組織內，從而有利于抗原遞呈 細胞的吞噬。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種精子特異性陽離子通道蛋白 CatSper1的基因疫苗；目的之二在于提供所述精子特異性陽離子通道蛋白 CatSper1的基因疫苗的制備方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

1、精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的基因疫苗，該疫苗是由CatSper1 和BAFF雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil?A、膽固醇及卵磷脂組成的 ISCOM型疫苗。

進一步，所述CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體是在含有內部 核糖體進入位點IRES的雙基因共表達真核載體的IRES上游和下游分別插入 CatSper1全長cDNA和BAFF全長cDNA；

進一步，所述CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體、皂苷Quil?A、 膽固醇及卵磷脂的質量比為5∶10∶1∶1。

2、所述精子特異性陽離子通道蛋白CatSper1的基因疫苗的制備方法，包括 以下步驟：

a、CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體的構建：將CatSper1全長 cDNA插入含有IRES的雙基因共表達真核載體的IRES上游，再將B細胞激活 因子全長cDNA插入該真核載體的IRES下游，即得CatSper1和B細胞激活因 子雙基因共表達重組真核載體；

b、ISCOM的制備：將CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體用磷 酸鹽緩沖液即PBS溶解后，加入皂苷Quil?A，再加入膽固醇及卵磷脂，使每毫 升溶液中含有CatSper1和BAFF雙基因共表達重組真核載體0.5mg、皂苷Quil?A 1mg、膽固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超聲處理使溶液充分混勻并乳化，再 用PBS透析，所得微絮狀物即為形成的ISCOM，也即CatSper1的基因疫苗。

進一步，所述步驟a的具體方法為：

a1、CatSper1全長cDNA的克隆：提取人成熟精子細胞總RNA，逆轉錄得 到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列 為上下游引物，PCR擴增兩端分別帶有Pst?I和EcoR?I酶切位點的CatSper1全 長cDNA，PCR條件為：94℃預變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘、58℃退火 1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環，最后72℃延伸7分鐘；PCR產物經純 化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT-CatSper1；