[發(fā)明專利]一種巴馬香豬體細(xì)胞克隆的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010142016.8
• 申請(qǐng)日: 2010-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN101857878A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧晟盛;盧克煥;劉紅波;胡林林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/877
• 分類號(hào): C12N15/877;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 王素娥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物繁殖、動(dòng)物胚胎生物技術(shù)，具體是一種巴馬香豬體細(xì)胞克隆的方法。

背景技術(shù)

至今并未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明相同或相似的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了：

1.解決人類異種器官移植所進(jìn)行轉(zhuǎn)基因豬研究必需的關(guān)鍵技術(shù)問題，為基因打靶豬和異種器官移植等研究奠定基本而又必要的研究手段。

2.為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)良地方品種巴馬香豬的保種開辟了一條新的途徑，也可大量繁育其它具有優(yōu)良性狀的種豬，解決優(yōu)良種豬引種、保種和品種改良等問題，大大加快優(yōu)良種豬引種、保種和品種改良的速度。

3.對(duì)探討豬早期胚胎發(fā)育的全能性，揭示豬胚胎、組織、個(gè)體發(fā)育中基因組印跡現(xiàn)象的本質(zhì)，對(duì)研究發(fā)育過程中同種動(dòng)物或異種動(dòng)物核質(zhì)互作關(guān)系，特別是對(duì)解決核遺傳物質(zhì)(核DNA)與細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)(線粒體DNA)的調(diào)控和相容性等發(fā)育核心問題均具有重要價(jià)值。

提供一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)良地方品種巴馬香豬體細(xì)胞克隆的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種巴馬香豬體細(xì)胞克隆的方法，是按以下步驟進(jìn)行操作：

1.相關(guān)試劑的配制

1)磷酸緩沖液DPBS的配制：

磷酸緩沖液DPBS的配制稱取：DPBS粉劑9.5克/L，青霉素66μg/L，和鏈霉素100μg/L，超純水定容，待藥品充分溶解后，用滅菌的濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存。

2)體細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM的配制：

體細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM的成分為：DMEM粉劑9.5g/L，44mM?NaHCO3，1mM丙酮酸鈉，66mg/L青霉素鈉和100mg/L硫酸鏈霉素，10％-15％的FCS和1％的非必需氨基酸。

DMEM粉末溶于超純水中，加入NaHCO₃，丙酮酸鈉，青霉素鈉和硫酸鏈霉素，然后調(diào)pH至7.2-7.4，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾除菌，分裝后儲(chǔ)于4℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们疤砑覨CS和非必需氨基酸。使用前放在培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱平衡。

3)細(xì)胞傳代消化液胰蛋白酶的配制：

細(xì)胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為：2.5mg/ml胰蛋白酶和0.2mg/mlEDTA-Na。

取胰蛋白酶和EDTA-Na溶解于磷酸緩沖液中，充分溶解完后，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾除菌，分裝后儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

4)體細(xì)胞冷凍液的配制：

10-15％FCS的DMEM培養(yǎng)液中加入10％DMSO。

5)洗卵液的配制：

洗卵液為改良TL-Hepes-PVA液，調(diào)pH至7.2-7.4后，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾分裝，放于4℃保存，1-4周內(nèi)用完，使用前放在35-39℃恒溫箱中預(yù)熱。

6)體外成熟液的配制：

體外成熟液為改良的TCM-199，其成分為：3.05mM?D-glucose，0.91mMSodium?pyruvate，26.19mM?NaHCO₃，0.09mM?EDTA·Na₄·2H₂O，75μg/mlPenicillin?G，50μg/ml?Streptomycin，0.57mM半胱氨酸、10ng/ml?EGF，0.5μg/ml?FSH，0.5μg/ml?LH和10％卵泡液；用濾膜孔徑為0.22μm濾器過濾，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们埃诔墒煲褐刑砑影腚装彼帷GF，F(xiàn)SH，LH和卵泡液。

7)胚胎培養(yǎng)液的配制：

采用NCSU-23或者PZM-3培養(yǎng)液用于重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7.2-7.4，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存，1-4周內(nèi)用完。

8)核移植操作液的配制：

在洗卵液中添加5-15％FCS，使用前將其放在35-39℃恒溫箱中預(yù)熱。

9)融合激活液：

稱取0.25M甘露醇，0.1mM?CaCl₂·2H₂O，0.1mM?MgSO4·7H₂O，0.5mMHepes，用超純水定容，調(diào)整pH值7.2-7.4，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存，使用前在35-39℃恒溫箱中預(yù)熱。

10)細(xì)胞松弛素B的配制：

用DMSO溶解細(xì)胞松弛素B(CB)，最終工作濃度為5-7.5ug/ml，分裝到Eppendorf管中，-20至-80℃凍存，工作濃度為5-7.5μg/ml。

11)豬卵泡液的配制：