[發(fā)明專利]一種巴馬香豬體細(xì)胞克隆的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010142016.8
• 申請日: 2010-04-08
• 公開（公告）號: CN101857878A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧晟盛;盧克煥;劉紅波;胡林林
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12N15/877
• 分類號: C12N15/877;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 王素娥

1.一種巴馬香豬體細(xì)胞克隆的方法，其特征在于，按以下步驟進(jìn)行操作：

1)相關(guān)試劑的配制：

(1)磷酸緩沖液DPBS的配制

磷酸緩沖液DPBS的配制稱取：DPBS粉劑9.5克/L，青霉素66μg/L，和鏈霉素100μg/L，超純水定容，待藥品充分溶解后，用滅菌的濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存；

(2)體細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM的配制：

體細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM的成分為：DMEM粉劑9.5g/L，44mM?NaHCO3，1mM丙酮酸鈉，66mg/L青霉素鈉和100mg/L硫酸鏈霉素，10％-15％的FCS和1％的非必需氨基酸；

DMEM粉末溶于超純水中，加入NaHCO₃，丙酮酸鈉，青霉素鈉和硫酸鏈霉素，然后調(diào)pH至7.2-7.4，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾除菌，分裝后儲于4℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们疤砑覨CS和非必需氨基酸。使用前放在培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱平衡；

(3)細(xì)胞傳代消化液胰蛋白酶的配制：

細(xì)胞傳代消化液胰蛋白酶的成分為：2.5mg/ml胰蛋白酶和0.2mg/mlEDTA-Na；

取胰蛋白酶和EDTA-Na溶解于磷酸緩沖液中，充分溶解完后，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾除菌，分裝后儲于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)體細(xì)胞冷凍液的配制：

10-15％FCS的DMEM培養(yǎng)液中加入10％DMSO；

(5)洗卵液的配制：

洗卵液為改良TL-Hepes-PVA液，調(diào)pH至7.2-7.4后，用濾膜孔徑為0.22μm濾器過濾分裝，放于4℃保存，1-4周內(nèi)用完，使用前放在35-39℃恒溫箱中預(yù)熱；

(6)體外成熟液的配制：

體外成熟液為改良的TCM199，其成分為：3.05mM?D-glucose，0.91mMSodium?pyruvate，26.19mM?NaHCO₃，0.09mM?EDTA·Na₄·2H₂O，75μg/mlPenicillin?G，50μg/ml?Streptomycin，0.57mM半胱氨酸、10ng/ml?EGF，0.5μg/ml?FSH，0.5μg/ml?LH和10％卵泡液；用濾孔為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们埃诔墒煲褐刑砑影腚装彼帷GF，F(xiàn)SH，LH和卵泡液；

(7)胚胎培養(yǎng)液的配制：

采用NCSU-23或者PZM-3培養(yǎng)液用于重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7.2-7.4，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存，使用前添加BSA，1-4周內(nèi)用完；

(8)核移植操作液的配制：

在洗卵液中添加5-15％FCS，使用前將其放在35-39℃恒溫箱中預(yù)熱；

(9)融合激活液：

稱取0.25M甘露醇，0.1mM?CaCl₂·2H₂O，0.1mM?MgSO4·7H₂O，0.5mMHepes，用超純水定容，調(diào)整pH值7.2-7.4，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，4℃保存，使用前在30-39℃恒溫箱中預(yù)熱；

(10)細(xì)胞松弛素B的配制：

用DMSO溶解細(xì)胞松弛素B(CB)，最終工作濃度為5-7.5μg/ml，分裝到Eppendorf管中，-20至-80℃凍存，工作濃度為5-7.5μg/ml；

(11)豬卵泡液的配制：

抽取豬卵巢上直徑3-8mm的卵泡，將抽取液放入離心管中離心，收集上清液，用濾膜孔徑為0.22μm的濾器過濾，分裝，-20至-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(12)FSH和LH儲存液的配制：

取TCM-199成熟液儲存液放入小瓶內(nèi)，先稱量少量BSA或者血清溶解后，再加入FSH，充分溶解后，過濾除菌，分裝，-20至-80℃保存?zhèn)溆茫挥猛瑯臃椒ㄅ渲芁H，使用時(shí)將其添加到豬卵母細(xì)胞成熟液中，最終濃度為0.5-1.0μg/ml；

(13)Hyaluronidase的配制：

透明質(zhì)酸酶儲存液的配制：稱取透明質(zhì)酸酶，加入到含BSA或者血清的洗卵液中，過濾，分裝到Eppendorf管中，-20至-80℃保存。使用時(shí)稀釋；

(14)EGF儲液的配制：

稱量EGF加入含BSA或者血清的TCM-199成熟液，分裝，-20至-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)巴馬香豬體細(xì)胞的培養(yǎng)：

將巴馬香豬用75％酒精噴過后，迅速用磷酸緩沖液或者生理鹽水沖洗，然后用滅菌過的手術(shù)刀或者剪刀，獲取其組織，將其放入含青、鏈霉素的磷酸緩沖液或者生理鹽水中清洗，然后用75％酒精快速清洗后，再用含青、鏈霉素的磷酸緩沖液或者生理鹽水中徹底清洗；

在超凈工作臺內(nèi)，把組織塊移到滅菌過的小瓶中，用眼科剪將其剪碎，加入磷酸緩沖液或者生理鹽水，將剪碎的組織塊移到滅菌離心管中離心，洗滌，棄掉上清，向沉淀中加入少許DMEM全基培養(yǎng)液，把剪碎的組織塊移到培養(yǎng)皿中攤均勻，轉(zhuǎn)入5％CO₂培養(yǎng)箱(37℃和最大飽和濕度)培養(yǎng)，第二天加入DMEM培養(yǎng)液；以后每2-3天換液一次，待細(xì)胞長到70-80％匯合時(shí)，輕輕撥掉組織塊，然后將其和培養(yǎng)液一起清除，用DPBS清洗，用胰蛋白酶溶液消化，然后加入DMEM終止消化，并輕輕吹打；然后將液體移到滅菌的離心管中，離心，棄掉上清，再向離心管中加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度后，接種到培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天換液一次。70-90％匯合時(shí)，將細(xì)胞傳代或冷凍；

3)巴馬香豬體細(xì)胞的冷凍：

巴馬香豬體細(xì)胞體外培養(yǎng)長到70-90％匯合時(shí)，用磷酸緩沖液清洗細(xì)胞，然后加入胰蛋白酶溶液作用，待大部分細(xì)胞變圓部分細(xì)胞已脫壁時(shí)迅速加入DMEM終止消化，吹打至細(xì)胞完全脫壁，把細(xì)胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入細(xì)胞凍存液，吹打均勻后分裝到細(xì)胞凍存管內(nèi)，于4℃冰箱中置一段時(shí)間，再放入-20至-80℃冰箱過夜，過夜后直接將凍存管放入-80℃液氮罐中；

4)冷凍體細(xì)胞的解凍：

從-80℃液氮中取出凍存管，快速投入30-37℃溫水中，不斷搖動凍存管，待冰塊全部融化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)液，離心清洗，然后用預(yù)熱的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度后接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)；

5)豬卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)：

從屠宰場收集豬卵巢，放入含有雙抗的30-37℃生理鹽水或者磷酸緩沖液中，送回實(shí)驗(yàn)室，用含雙抗的生理鹽水或者磷酸緩沖液沖洗，帶入無菌操作室，用裝有針頭的注射器抽取卵巢表面直徑為2～6mm的卵泡，將抽取的卵泡液放入玻璃或者塑料管中，靜置一段時(shí)間，用洗卵液稀釋后放在實(shí)體顯微鏡下，用玻璃吸管挑選帶有2層以上卵丘細(xì)胞、胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，在洗卵液中洗滌，用預(yù)平衡的成熟液洗滌，最后放入含F(xiàn)SH和LH的成熟液滴中，培養(yǎng)22小時(shí)，然后移入不含激素的新鮮成熟液滴中繼續(xù)培養(yǎng)22-24小時(shí)，培養(yǎng)條件為：5％CO₂、最大飽和濕度、38.5-39℃；

6)核移植：

(1)卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備：

將體外培養(yǎng)40-44h的豬卵母細(xì)胞在透明質(zhì)酸酶中作用，輕輕吹打除去周圍卵丘細(xì)胞，用玻璃撥卵針在實(shí)體顯微鏡下輕輕轉(zhuǎn)動卵母細(xì)胞，挑選出胞質(zhì)均勻且有極體排放的卵母細(xì)胞為核移植備用；

(2)巴馬香豬體細(xì)胞的準(zhǔn)備：

把3-10代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用DPBS清洗后，加入胰蛋白酶溶液作用，待70-90％的細(xì)胞已脫壁時(shí)，加入預(yù)熱的DMEM終止消化，輕輕吹打，然后將細(xì)胞混合液移到離心管中，離心，棄掉上清液，加入顯微操作液，重懸細(xì)胞離心洗滌，棄上清后加入顯微操作液，重懸細(xì)胞，然后再向混合液中加入CB，使終濃度為5-7.5μg/ml；

(3)操作滴的準(zhǔn)備：

用上述調(diào)整好的細(xì)胞懸液，做成長條型液滴，上面覆蓋石蠟油，將挑選出的卵母細(xì)胞放在操作液滴中，在顯微操作儀下去核操作。吸取中等大小圓形、表面光滑，細(xì)胞膜折光度較好的供體細(xì)胞通過透明帶切口注射到透明帶下方，并輕點(diǎn)透明帶使供體與卵母細(xì)胞膜接觸良好；

(4)重構(gòu)卵的融合/激活和培養(yǎng)：

將重構(gòu)卵放在含有CB的胚胎培養(yǎng)液滴中，恢復(fù)一段時(shí)間，然后把恢復(fù)好的重構(gòu)卵移到融合液中洗滌，把每批重構(gòu)卵放在鋪滿融合液的融合槽兩電極間，用玻璃針輕輕轉(zhuǎn)動重構(gòu)卵，使注入的體細(xì)胞與兩電極平行，隨后按下融合儀開關(guān)，進(jìn)行融合，直至重構(gòu)卵激活完畢，融合后的重構(gòu)卵用胚胎培養(yǎng)液洗滌，放入平衡好的含CB的胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)一段時(shí)間，挑選融合好的重構(gòu)卵，用胚胎培養(yǎng)液洗滌，然后移到胚胎培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：38.5-39℃，5％CO₂，最大飽和濕度；

7)胚胎移植：

選用后備或經(jīng)產(chǎn)的豬作為受體母豬，停喂食料，將胚胎移植當(dāng)天和前一天構(gòu)建的核移植胚胎和孤雌激活胚胎置入平衡到37-39℃的便攜式恒溫箱中，受體母豬進(jìn)行麻醉后綁定，清洗手術(shù)部位并消毒，準(zhǔn)備手術(shù)，將手放入腹腔內(nèi)找出輸卵管和卵巢，適當(dāng)拉出，采用刺入式胚胎移植法進(jìn)行胚胎移植，從便攜式恒溫箱中取出待移植胚胎，刺入輸卵管后將胚胎緩緩地輸入其中，輸畢，撤出，并進(jìn)行縫合，術(shù)后連續(xù)兩天注射青、鏈霉素防止炎癥發(fā)生，單獨(dú)隔離受體母豬，注意觀察愈后情況。