[發(fā)明專利]抗蝰蛇蛇毒凍干血清及制備方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201010141970.5 | 申請(qǐng)日： | 2010-04-08 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN101816789A | 公開（公告）日： | 2010-09-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 范泉水;鄭穎;邱薇;張富強(qiáng);葉鋒平;周衛(wèi)國;張志曉 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心軍事醫(yī)學(xué)研究所 |
| 主分類號(hào)： | A61K39/395 | 分類號(hào)： | A61K39/395;A61K35/16;A61P39/02;A61P37/08 |
| 代理公司： | 昆明科陽知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 53111 | 代理人： | 孫山明 |
| 地址： | 650032 云*** | 國省代碼： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 蝰蛇 蛇毒 血清 制備 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥制品，特別涉及抗蛇毒血清及制備工藝。
背景技術(shù)
蝰蛇(Vipera?russelli?siamensi)屬蝰科蝰亞科，是以血液循環(huán)毒素為主 的劇毒蛇類。我國蝰蛇主要分布于廣西、廣東、福建和臺(tái)灣。蝰蛇晝夜活動(dòng)， 蟠蜷成團(tuán)，行動(dòng)較遲緩，蛇性兇猛。蝰蛇毒主要含血循毒，有毒成分以凝血毒 素為主，還有溶血毒素、纖維蛋白溶解毒素、抗凝血成分、血小板積聚變性成 分、出血毒素等。人被咬傷后發(fā)病急、癥狀重，傷口腫痛，出血、引起血管內(nèi) 廣泛凝血DIC危險(xiǎn)癥狀，患者可因溶血而致貧血及黃疸、腎功能衰竭，甚至肺 出血及腦出血；蝰蛇毒素還可損害心肌，造成中毒性心肌炎和心肌功能衰竭。 蝰蛇咬傷致死率約為30％。相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中，發(fā)明申請(qǐng)?zhí)?005100303946“抗 蝰蛇血清及其制備方法”提供了由園斑蝰蛇毒免疫馬獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消 化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑，每毫升血清可中和蝰 蛇毒500LD50以上，相當(dāng)于4mg干毒，臨床試驗(yàn)有效率為98.5％，治愈率達(dá)91 ％。即使以2010年版“中國藥典”抗蛇毒血清F(ab′)2片段純度僅要求不低 于60％。但是，園斑蝰蛇是蝰科蛇類亞種，不同亞種間抗原特異性差異較大， 單一蛇毒免疫血漿生產(chǎn)的F(ab′)2只能與相應(yīng)抗原決定簇特異性結(jié)合，加之 蝰蛇一次排毒量大，毒性強(qiáng)，因而其局限是明顯的；而濃縮原液以氯仿為溶劑 且含量較大(1.4-0.6％)以及明礬絮凝沉淀蛋白都對(duì)人體存在潛在損傷；另一 方面，不僅血清水解鹽析獲得的成品純度低(F(ab′)2≥60％)導(dǎo)致抗體效價(jià)較 低，而且，由于抗血清含有較多大分子量IgG和激活補(bǔ)體的Fc片段，成為臨 床發(fā)生抗血清過敏反應(yīng)除個(gè)體差異外最主要的因素，因此，若要較徹底地去除 這些導(dǎo)致過敏成分在制備中只利用鹽析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的首先是提供一種高效價(jià)的、特異性中和蝰蛇毒的抗蝰蛇蛇毒血 清，其次是提供一種利用疏水層析純化鹽析后的F(ab′)2，可獲得高純度的F(ab ′)2制品，降低產(chǎn)品過敏反應(yīng)發(fā)生率的精制抗蝰蛇毒血清方法。
本發(fā)明的目的通過以下方式達(dá)到：
(一)作為成品的抗蝰蛇蛇毒凍干血清
該抗蛇毒血清F(ab′)2片段純度大于85％，分子量為97000～110000Da。 該抗蛇毒血清F(a?b′)2凍干品與蝰蛇毒質(zhì)量比為15∶1(mg∶mg)時(shí)能特異性 中和小鼠的蝰蛇毒。
該抗蛇毒血清免疫擴(kuò)散測定抗蝰蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒比例 在8∶1以下時(shí)出現(xiàn)清晰的免疫沉淀線。
(二)一種制備抗蝰蛇蛇毒凍干血清的方法
制備工藝依次包括如下步驟：
(1)將至少兩個(gè)產(chǎn)地不同亞種采集的蝰蛇毒混合作為免疫原免疫馬得到 具有特異性IgG血漿；
(2)取以上免疫血漿，用硫酸銨分步鹽析獲得IgG組分；
(3)用無菌水補(bǔ)I?gG溶液體積，調(diào)pH值，加入胃蛋白酶水解IgG離心收 集上清液即取得F(ab′)2粗品；
(4)將以上F(ab′)2粗品用3mo?l/L的硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)后到100-110ms/cm 后上預(yù)先用1.2mol·L-1硫酸銨+50mmol·-1磷酸鈉緩沖液(pH?7.0)平衡好的 Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱，用該緩沖液淋洗1-3倍柱床體積后，用 注射用水線性梯度(0％→100％，3倍柱床體積)洗脫，收集洗脫1峰，脫鹽過 濾凍干。
所述抗蛇毒血清Phenyl-Sepharose(low-sub)FF柱層析結(jié)果經(jīng)活性和純 度檢測，活性集中在洗脫1峰上，F(xiàn)(ab′)2SDS-PAGE純度大于85％；小分子 雜蛋白質(zhì)集中在小分子雜蛋白集中在穿透峰、洗脫2、洗脫3峰上。分離圖譜 如圖1所示。
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