[發(fā)明專利]表達(dá)PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010140804.3
• 申請日: 2010-04-07
• 公開（公告）號: CN101792743A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許信剛;童德文;張琪
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/866;A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京匯澤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 黃挺

1.一種表達(dá)PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒帶有SEQ?ID?NO.1所示的序列，所述重組桿狀病毒表面展示PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白ORF2，

所述重組桿狀病毒的制備方法，步驟包括：

a、制備SEQ?ID?NO.1所示的ORF2基因；????

b、將上述的ORF2基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動子下游，構(gòu)建含PCV-2的ORF2基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-ORF2；

c、將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-ORF2轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，得重組桿狀病毒DNA；

d、將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，得到重組桿狀病毒;

其中，所述pBacSC載體的構(gòu)建過程：

1.1????引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)發(fā)表的如GenBank:?AY542374所示的桿狀病毒AcMNPV的gp64基因組序列和如GenBank：EU048697所示的綠色熒光蛋白（eGFP）基因的基因組序列，設(shè)計(jì)3對特異性引物Pl/P2、P3/P4、P5/P6;

上游引物P1???5'-?TCACCCGGG?ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3'，5'?端加上?SmaI酶切位點(diǎn)；下游引物P2???5'-?GTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGCACCACCACCACCACCACGCGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC?-3'；上游引物P3???5'-?GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCTAGTGTTTGGTCATGTA?-3'?；?下游引物P4??5'-?CCC?GGTACCTTAATATTGTCTATTAC?-3'，5'?端加上?Kpn?I酶切位點(diǎn)；預(yù)期擴(kuò)增片斷為267bp，含有GP64?信號肽（SP）序列，6個組氨酸（His6）標(biāo)簽，4個多克隆位點(diǎn)，即BsshI、NcoI、NheI、SphI，GP64?跨膜區(qū)（TM）和GP64胞質(zhì)區(qū)（?CTD）基因；

上游引物P5??5'-?GCTGGATCC?ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT?-3'，5'端加上?BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物P6??5'-?AAGCTT?CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA?-3'，5'?端加上HindIII酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片斷為717bp，含有完整的綠色熒光蛋白基因（eGFP）基因；

1.2????如SEQ?ID?NO.2所示的?SP－His6－四個酶切位點(diǎn)－TM－CTD?序列的擴(kuò)增：

PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR?Buffer?5μL、dNTPs?4μL、P1/P2?，P3/P4各1μL、Taq?DNA多聚酶1μL、加水至50μL，反應(yīng)程序：95℃變性5min；94℃?1min，56℃?1min，72℃?30sec，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，反應(yīng)結(jié)束后取10μL?PCR產(chǎn)物加入1μL?6×Loading?Buffer于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物；

1.3????eGFP基因的擴(kuò)增：

PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR?Buffer?5μL、dNTPs?4μL、P5/P6各1μL、Taq?DNA多聚酶1μL、pEGFP-C1質(zhì)粒1μL、加水至50μL，反應(yīng)程序：95℃變性5min；94℃?1min，56℃?1min，72℃?2min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，反應(yīng)結(jié)束后取10μL?PCR產(chǎn)物加入1μL?6×Loading?Buffer于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物；

1.4?????PCR產(chǎn)物與pFastBacTM?Dual載體的連接

參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說明書回收目的基因，將eGFP基因插入載體pFastBacTM?Dual的Polyhedrin?啟動子下游的多克隆位點(diǎn)（MCS）的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)處，同樣方法將SP－His6－四個酶切位點(diǎn)－TM－CTD基因插入到已經(jīng)插入了eGFP基因的pFastBacTM?Dual載體的另外一個p10?啟動子下游多克隆位點(diǎn)（MCS）的SmaI和KpnI酶切位點(diǎn)處，從而構(gòu)建成功pBacSC載體。