[發明專利]表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應用

無效

• 申請號: 201010140804.3
• 申請日: 2010-04-07
• 公開（公告）號: CN101792743A
• 公開（公告）日: 2010-08-04
• 發明（設計）人: 許信剛;童德文;張琪
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N15/866;A61K48/00;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 黃挺

技術領域

本發明涉及一種表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應用。

背景技術

豬圓環病毒(PCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是圓環病毒屬的代表種， 它是一種小而無囊膜、二十面體對稱、共價閉合、環狀、單股DNA病毒，病 毒粒子直徑平均為17nm，是目前獸醫學上發現的最小的動物病毒。

PCV可分為兩個血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1對豬無致病性，為非 致病性PCV，PCV-2對豬有致病性，可引起PMWS(斷奶仔豬多系統衰竭綜合 征)，又稱PMWS相關PCV。1991年加拿大首次爆發該病，隨后世界上許多國 家和地區都有該病的報道，目前我國的很多豬場均有該病存在，給我國的養豬 業造成嚴重的經濟損失。

Hamel等通過對PCV基因組分析，發現PCV-1和PCV-2均可能含有11個 開放閱讀框(0RF)。PCV各閱讀框中，ORF1和ORF2為主要閱讀框，現已證 實ORF1編碼是與病毒復制相關的Rep蛋白，而PCV-2的ORF2基因編碼病毒 核衣殼蛋白(Cap)，也是病毒的保護性抗原。Liu等將ORF2基因連接到 MBP-His(8)-tag基因3’端，在細菌中表達ORF2融合蛋白，發現該融合蛋白可 被抗PCV-2多克隆抗體和PCV-2感染豬血清識別，表明ORF2蛋白與PCV-2 的免疫反應性有關。Truong等用從實驗性感染豬制備的PCV-2抗血清，建立 ELISA方法，發現PCV2-ORF2編碼蛋白具有與抗原性相關的線性表位，其中 從69-83和117-131殘基的兩個抗原表位對PCV-2來說具型有特異性，ORF2 抗原表位可以作為PCV-2感染的血清學標志以檢測PCV-2抗體效價。

PCV-2是目前嚴重威脅養豬業發展的一種重要的病毒。目前對PCV-2的控 制目前尚無疫苗。因此發展新型疫苗來控制PCV-2已是當務之急。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種重組桿狀病毒及可作為預防PCV-2感 染的亞單位疫苗。

本發明提供的一種表達PCV-2免疫原基因的重組桿狀病毒，帶有SEQ?ID NO.1所示的序列。所述重組桿狀病毒表面展示PCV-2結構蛋白ORF2。

本發明提供一種上述的重組桿狀病毒的制備方法，步驟包括：

a、制備ORF2基因。制備方法為：用PCR方法擴增了PCV-2陜西株ORF2 基因，并將其克隆到pMD18-T載體，構建了pMD18T-ORF2質粒；

b、將PCV-2的ORF2基因，插入到桿狀病毒表面展示轉座載體pBacSC的 p10啟動子下游，構建含PCV-2的ORF2基因的重組桿狀病毒轉座質粒 pBacSC-ORF2；

c、將上述重組桿狀病毒轉座質粒pBacSC-ORF2轉入大腸桿菌內進行同源 重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA。作為優選，所述大腸桿菌為感受態大腸 桿菌DH10Bac。

d、將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉染昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。 優選地，將重組桿狀病毒DNA通過脂質體介導方法轉入昆蟲細胞Sf9中，包裝 出重組桿狀病毒。

本發明提供一種上述的重組桿狀病毒在制備豬圓環病毒疫苗中的應用。

本發明提供一種制備豬圓環病毒疫苗的方法：所述重組病毒接種昆蟲細胞， 培養48～72h，收取感染細胞，-40℃/37℃凍融，離心，取上清測定病毒PFU， 調整病毒的滴度使其達到10⁹PFU/ml。上述昆蟲細胞優選Sf9昆蟲細胞。

本發明的優點和積極效果為：

1、本發明得到的重組桿狀病毒BacSC-ORF2可表面展示PCV-2結構蛋白 ORF2，直接經過超速離心得到桿狀病毒的同時也就得到了目的蛋白，可以避免 現有技術中表達系統(包括傳統的桿狀病毒表達系統)表達目的蛋白分離純化 的繁瑣過程。而，現有技術的表達系統中表達的目的蛋白是分泌到Sf9細胞的 培養基中，需要通過蛋白純化系統來純化目的蛋白，這樣費時費力，代價昂貴， 不能大規模應用于目的蛋白的規模化生產，這也是目前蛋白表達最令人頭疼的 地方。

2、轉座載體中添加eGFP基因，可以通過熒光顯微鏡直接觀察熒光的有無 來檢測重組病毒的產生情況，大大簡化病毒滴度的測定。

3、該重組桿狀病毒表面展示的蛋白可與PCV-2抗體發生特異性反應。