[發明專利]一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株及其構建方法

無效

• 申請號: 201010140193.2
• 申請日: 2010-03-30
• 公開（公告）號: CN101831408A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 廖明;張賀楠;曹偉勝;賴漢漳;羅開健;徐成剛;辛朝安
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/08;C12N15/85;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒研究領域，尤其涉及一種E元件(XSR)缺失血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株及其構建方法。

背景技術

本發明人已經從血管瘤病變型禽白血病海蘭褐蛋雞中分離得到血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株，并獲得了血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的全長基因組序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。

J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株與ALV-J原型株HPRS-103在LTR(長末端重復區)有相似的特點，即與其它亞群禽白血病病毒相比，在其3’LTR區域存在一個具有被稱作E元件的發夾頸環結構，該元件以前僅存在于急性轉化型Rous肉瘤病毒src基因上游或下游，長約150bp。

E元件的功能目前還不十分清楚，但它含有轉錄因子c/EBP的黏著位點且可發揮增強子的功能。在對于自然分離的重組嵌合病毒ALV-J/A研究中發現，E元件與致瘤性有關，但這個研究是以自然分離株為研究對象的，自然分離株存在著眾多的序列突變與缺失，而這些突變或缺失可能都會對病毒的致病性產生影響，從而影響了E元件在病毒致病性及其致病機理的研究。

本發明人根據血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列，構建得到含有該基因序列的質粒pSK-ALV-HN，其構建步驟如下：

(1)根據血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列(其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示)設計六條特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6～11所示；

(2)利用核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6～11所示的六條特異引物將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示)分三段進行擴增，并分別克隆于pMD18-T?simple?vector載體，構建得到三個質粒，分別命名為pHN-A-T、pHN-B-T和pHN-C-T；以SEQ?ID?NO1所示基因為模板，將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株病毒液接種雞胚成纖維細胞，7天后提取細胞總基因組DNA，做為模板，

(3)將質粒pHN-A-T、pHN-B-T分別用SalI和EcoRI雙酶切消化，回收目的片段，經連接和轉化后，挑取單一菌落鑒定克隆，將獲得的重組質粒命名為pHN-(A+B)-T；

(4)將pHN-(A+B)-T和pHN-C-T分別用Kpn?I和NotI雙酶消化，回收目的片段，經連接和轉化后，挑取單一菌落鑒定克隆，將最后獲得的重組質粒命名為pMD18-ALV-HN，并測序驗證，結果證明重組質粒pMD18-ALV-HN中含有血管瘤病變型ALV-J?SCAU-HN06株前病毒全基因組序列；

(5)將質粒pMD18-ALV-HN中含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株前病毒全基因組序列亞克隆到pBlueskript?SK(-)載體，得到含有血管瘤病變型ALV-J?SCAU-HN06株病毒基因的質粒，并命名為pSK-ALV-HN。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一株可用于E元件的病毒致病性及其致病機理研究的E元件缺失血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒株。

本發明的另一個目的在于提供上述血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒株的構建方法。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已于2009年11月3日保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC?NO：V200914。

上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株是采用感染型克隆技術，通過對血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示)進行E元件缺失，構建而得。

上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構建方法，具體包括如下步驟：

(1)特異性引物

特異性引物一共四條，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1～4所示；