[發明專利]一種基于PCR的低成本、簡單、高效的SNP檢測方法

無效

• 申請號: 201010139370.5
• 申請日: 2010-03-12
• 公開（公告）號: CN102191314A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 孫朝輝
• 申請（專利權）人: 孫朝輝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G06F19/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

專利領域

本發明屬于生物技術，涉及遺傳學檢測領域。

技術背景

近年來，隨著大規模DNA(脫氧核糖核酸)測序技術的迅速發展，科學家已經能夠廣泛了解重要的DNA區域的編碼，并研究不同人的個體之間的DNA差異；遺傳學家利用這些手段和數據做了大量研究，成功地找到了許多人的遺傳多樣性與疾病或其他性狀的聯系。科學家研究最多的遺傳標記是單核苷酸多態性(SNP)，即同一物種的不同個體在基因組DNA某一單核苷酸位點上的差異。SNP有廣泛的用途。SNP對疾病產生的機制有影響，也對個體對藥物，病原體，疫苗的反應有影響。類似的，SNP在別的生物學領域，比如對于莊稼和牲畜的培育都有重要作用。

由于SNP在科學研究和應用上的價值，已經涌現出多種SNP分型(檢測)的技術(參考資料1)。下面對主要的技術進行分類介紹。

1.測序。最常見的方式是對包括該SNP的周邊區域的DNA進行測序。這種方法較為直接可靠，被很多遺傳學科研實驗室采用。其缺點是需要昂貴的測序設備，費用高，通量低速度慢。

2.限制性內切酶長度多樣性(RFLP)。這是最早最簡單的一種檢測方法。限制性內切酶有很多種，每種都能以很高的親合力與特異的DNA限制性位點結合并切斷DNA。在使用多種限制性內切酶對基因組DNA進行消化后，再用凝膠電泳檢測片斷大小，就有可能知道內切酶是否切斷了一個預期的限制性位點。如果沒有切斷，則膠電泳檢測不到那個預期大小的片斷，則表明該位點(SNP)有不同的核苷酸。然而，由于真核生物基因組的復雜性及這種方法針對不同位點需要特定內切酶的特性，該方法一個反應往往只能做一個位點，無法增加通量。

3.PCR方法。針對SNP的不同的等位基因設計不同引物對該位點進行PCR擴增。這些引物與SNP周邊的序列配對，但每種只與SNP上的一個等位基因配對。每種不同的引物只擴增出與之對應的SNP等位基因型。兩種引物得到的產物片段大小有一定的差異，因此可以通過檢測區分。PCR方法簡單，設備需要小，較為經濟，但設計出特異性好又能高效多重化的引物則有較大難度，并且實驗經常需要摸索條件，因而也不容易做高通量的檢測。

4.翻轉內切酶法(Flap-endonuclease，或FEN)。兩個不同的寡聚核苷酸探針與一個SNP相結合，形成一定的結構，然后一種內切酶識別這個結構并將DNA切斷。其中，第一個探針與SNP的3’端DNA結合，第二個探針與特定的SNP等位基因結合。通過使用不同的第二探針，就可以檢測不同的SNP等位基因型。這里，DNA切割可以用熒光共震能量轉移(fluorescence?resonanceenergy?transfer，或FRET)系統來探測。該方法的靈敏度和特異性都較好，但目前也只能一次做單個SNP的檢測。

5.引物延伸法。這種方法有兩個步驟。首先，特異的探針與SNP位點的直接上游結合。然后，DNA多聚酶將探針的DNA延伸，使之含有該SNP的核苷酸。SNP的不同等位基因可以通過熒光標記檢測。一種常用的方法是在反應中加入帶有不同熒光標記的雙脫氧核苷酸(ddNTP)，在引物與SNP上游結合后讓其延伸單個堿基，然后通過檢測加上的不同ddNTP的熒光，就可以知道這個SNP的等位基因是哪個。Sequenom′s?iPLEX系統采用了這種方法，并用質譜儀來檢測。該方法適合用來檢測中等數目(小于40)的SNP，但需要較昂貴的專門儀器。Illumina的Infinium系統也是基于這類方法，但它使用了抗體檢測。該方法可以做超過10000個SNP的檢測，適合全基因組掃描，但是價格較貴。APEX-2方法則將引物延伸法與基因芯片技術結合起來，也能達到高通量。

6.5’-核酸酶法。TaqMan檢測法利用了Taq?DNA多聚酶的5’核酸酶活性。這種方法用5’和3’端的PCR引物來擴增含SNP的區域，再用FRET系統結合兩個特異的DNA探針來區分不同的等位基因。這些探針在5’端有熒光基團，3’端有熄滅基團，因此在探針完整時不產生熒光。在PCR過程中，如果該探針序列與SNP特異配對，則可以與目標DNA完美結合，然后Taq酶在進行DNA擴增時就可以將探針的5’端降解，熒光基團就游離出來并發光。如果該探針序列與SNP不特異配對，則與目標DNA不能完美結合，5’核酸酶活性就無法使探針的5’端降解。TaqMan法可以用來檢測最多7個SNP。如果在一塊板上同時進行多個反應，可以達到很高的通量。